Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłość wsparcia, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Termofile to mikroorganizmy, które rozwijają się w wysokich temperaturach. Badanie ich może dostarczyć cennych informacji na temat tego, jak życie przystosowuje się do ekstremalnych warunków. Jednak osiągnięcie warunków wysokiej temperatury za pomocą konwencjonalnych mikroskopów optycznych jest trudne. Zaproponowano kilka domowych rozwiązań opartych na lokalnym, rezystancyjnym ogrzewaniu elektrycznym, ale nie ma prostego rozwiązania komercyjnego. W tym artykule przedstawiamy koncepcję ogrzewania laserem w mikroskali w polu widzenia mikroskopu, aby zapewnić wysokie temperatury do badań termofilnych, zachowując jednocześnie łagodne środowisko użytkownika. Ogrzewanie w mikroskali przy umiarkowanej intensywności lasera można osiągnąć przy użyciu podłoża pokrytego nanocząsteczkami złota jako biokompatybilnego i wydajnego pochłaniacza światła. Omówiono możliwe skutki konwekcji płynu w mikroskali, retencji komórek i odśrodkowego ruchu termoforetycznego. Metodę wykazano na dwóch gatunkach: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktywna termofilna bakteria rozmnażająca się w temperaturze około 65°C, która, jak zaobserwowaliśmy, kiełkuje, rośnie i pływa w warunkach ogrzewania w mikroskali; (ii) Thiobacillus sp., archeony optymalnie hipertermofilne. w temperaturze 80°C. Praca ta toruje drogę do prostej i bezpiecznej obserwacji mikroorganizmów termofilnych przy użyciu nowoczesnych i niedrogich narzędzi mikroskopowych.
Przez miliardy lat życie na Ziemi ewoluowało, aby dostosować się do szerokiego zakresu warunków środowiskowych, które z naszego ludzkiego punktu widzenia są czasami uważane za ekstremalne. W szczególności niektóre mikroorganizmy termofilne (bakterie, archeony, grzyby) zwane termofilami rozwijają się w zakresie temperatur od 45°C do 122°C1, 2, 3, 4. Termofile żyją w różnych ekosystemach, takich jak głębinowe kominy hydrotermalne, gorące źródła lub obszary wulkaniczne. Ich badania wzbudziły duże zainteresowanie w ciągu ostatnich kilku dekad z co najmniej dwóch powodów. Po pierwsze, możemy się z nich dowiedzieć na przykład, jak termofile 5, 6, enzymy 7, 8 i błony 9 są stabilne w tak wysokich temperaturach lub jak termofile mogą wytrzymać ekstremalne poziomy promieniowania10. Po drugie, stanowią podstawę wielu ważnych zastosowań biotechnologicznych1,11,12, takich jak produkcja paliw13,14,15,16, synteza chemiczna (dihydro, alkohole, metan, aminokwasy itp.)17, biomining18 i biokatalizatory termostabilne7,11, 13. W szczególności obecnie dobrze znana reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)19 obejmuje enzym (polimerazę Taq) wyizolowany z termofilnej bakterii Thermus aquaticus, jednej z pierwszych odkrytych termofilów.
Jednak badanie termofilów nie jest zadaniem łatwym i nie można ich zaimprowizować w żadnym laboratorium biologicznym. W szczególności żywych termofilów nie można obserwować in vitro za pomocą żadnego standardowego mikroskopu świetlnego, nawet w dostępnych na rynku komorach grzewczych, zwykle przystosowanych do temperatur tak niskich jak 40°C. Od lat 90. XX wieku tylko kilka grup badawczych poświęciło się wprowadzeniu systemów mikroskopii wysokotemperaturowej (HTM). W 1994 Glukh i in. Komora grzejno-chłodząca została zaprojektowana w oparciu o zastosowanie ogniwa Peltiera, które kontroluje temperaturę prostokątnych kapilar zamkniętych w celu utrzymania beztlenowości 20 . Urządzenie można nagrzewać do temperatury 100°C z szybkością 2°C/s, co pozwala autorom badać ruchliwość hipertermofilnej bakterii Thermotoga maritima21. W 1999 r. Horn i in. Opracowano bardzo podobne urządzenie, nadal oparte na zastosowaniu podgrzewanych kapilar odpowiednich do komercyjnej mikroskopii do badania podziału/łączenia komórek. Po długim okresie względnej bezczynności, w 2012 roku wznowiono poszukiwania skutecznych HTM, w szczególności w związku z serią artykułów grupy Wirth wykorzystującej urządzenie wynalezione przez Horna i in. Piętnaście lat temu badano ruchliwość dużej liczby archeonów, w tym hipertermofilów, w temperaturach do 100°C przy użyciu podgrzewanych naczyń włosowatych23,24. Zmodyfikowali także oryginalny mikroskop, aby uzyskać szybsze nagrzewanie (kilka minut zamiast 35 minut do osiągnięcia ustawionej temperatury) i liniowy gradient temperatury większy niż 2 cm w ośrodku. To urządzenie do kształtowania gradientu temperatury (TGFD) wykorzystano do badania mobilności wielu termofilów w obrębie gradientów temperatury w biologicznie istotnych odległościach 24, 25.
Ogrzewanie zamkniętych kapilar to nie jedyny sposób na obserwację żywych termofilów. W 2012 roku Kuwabara i in. Zastosowano domowe jednorazowe komory Pyrex uszczelnione żaroodpornym klejem (Super X2; Cemedine, Japonia). Próbki umieszczono na dostępnej w handlu przezroczystej płycie grzewczej (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonia) zdolnej do ogrzewania do 110°C, ale pierwotnie nieprzeznaczonej do bioobrazowania. Autorzy zaobserwowali efektywny podział beztlenowych bakterii termofilnych (Thermosipho globiformans, czas podwajania 24 min) w temperaturze 65°C. W 2020 r. Pulshen i in. Efektywne ogrzewanie komercyjnych naczyń metalowych (AttofluorTM, Thermofisher) wykazano przy użyciu dwóch domowych elementów grzejnych: pokrywy i stolika (konfiguracja inspirowana maszyną PCR). To połączenie skutkuje jednolitą temperaturą cieczy i zapobiega parowaniu i kondensacji na dnie pokrywy. Zastosowanie pierścienia typu O-ring pozwala uniknąć wymiany gazów z otoczeniem. Tego HTM, zwanego sulfoskopem, użyto do obrazowania Sulfolobus acidocaldarius w temperaturze 75°C27.
Uznanym ograniczeniem wszystkich tych systemów było ograniczenie stosowania obiektywów powietrznych, gdyż zanurzenie w oleju nie było odpowiednie dla tak wysokiej temperatury i do obrazowania przez przezroczyste próbki o grubości > 1 mm. Uznanym ograniczeniem wszystkich tych systemów było ograniczenie stosowania obiektywów powietrznych, gdyż zanurzenie w oleju nie było odpowiednie dla tak wysokiej temperatury i do obrazowania przez przezroczyste próbki o grubości > 1 mm. Оind пизнанныы недосczeń вех этих систем ыыло ораничение на исполззова Więc нное погржение васло не подходило для такой ы muszę Uznaną wadą wszystkich tych systemów było ograniczenie stosowania obiektywów powietrznych, ponieważ zanurzenie w oleju nie było odpowiednie dla tak wysokiej temperatury i wizualizacji przez przezroczyste próbki o grubości > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像。 Uznanym ograniczeniem wszystkich tych systemów jest ograniczenie stosowania zwierciadła napowietrzonego, ponieważ zanurzenie w oleju jest nieodpowiednie do obrazowania przezroczystych próbek o grubości > 1 mm w tak wysokich temperaturach. О_p. Наннныыыыоостатком вех ээих систем являentów ржение васло raunktur нодно для таких ысоких температр и виззалации чез прозрачныenia оиной> 1 пзз. Uznaną wadą wszystkich tych systemów jest ograniczone zastosowanie soczewek powietrznych, jakiekolwiek zanurzenie w oleju jest nieodpowiednie dla tak wysokich temperatur i wizualizacji przez przezroczyste próbki o grubości > 1 mm.Niedawno to ograniczenie zostało zniesione przez Charlesa-Orzaga i in. 28, który opracował urządzenie, które nie zapewnia już ciepła wokół interesującego układu, ale wewnątrz samej osłony, pokrytej cienką przezroczystą warstwą rezystora wykonanego z ITO (tlenku indu i cyny). Pokrywkę można podgrzać do temperatury 75°C, przepuszczając prąd elektryczny przez przezroczystą warstwę. Autor musi jednak także podgrzać obiektyw do obiektywu, ale nie więcej niż 65°C, aby go nie uszkodzić.
Prace te pokazują, że rozwój wydajnej wysokotemperaturowej mikroskopii optycznej nie został powszechnie przyjęty, często wymaga domowego sprzętu i często osiąga się kosztem rozdzielczości przestrzennej, co jest poważną wadą, biorąc pod uwagę fakt, że mikroorganizmy termofilne nie są większe niż kilka mikrometry. Zmniejszona objętość ogrzewania jest kluczem do rozwiązania trzech nieodłącznych problemów HTM: słabej rozdzielczości przestrzennej, dużej bezwładności cieplnej podczas nagrzewania się systemu oraz szkodliwego nagrzewania otaczających elementów (oleju immersyjnego, soczewki obiektywu… lub dłoni użytkownika) w ekstremalnych temperaturach. ).
W tym artykule przedstawiamy HTM do obserwacji termofilnych, który nie opiera się na ogrzewaniu rezystancyjnym. Zamiast tego uzyskaliśmy zlokalizowane ogrzewanie w ograniczonym obszarze pola widzenia mikroskopu poprzez napromienianie laserem podłoża pochłaniającego światło. Rozkład temperatury wizualizowano za pomocą ilościowej mikroskopii fazowej (QPM). Skuteczność tej metody wykazują Geobacillus stearothermophilus, ruchliwa bakteria termofilna, która rozmnaża się w temperaturze około 65°C i charakteryzuje się krótkim czasem podwajania (około 20 minut) oraz Sulfolobus shibatae, hipertermofil, który optymalnie rośnie w temperaturze 80°C (archeony). zilustrować. Zaobserwowano normalną szybkość replikacji i pływanie w funkcji temperatury. Ten laser HTM (LA-HTM) nie jest ograniczony grubością szkiełka nakrywkowego ani rodzajem obiektywu (zanurzenie w powietrzu lub oleju). Dzięki temu można zastosować dowolny obiektyw o wysokiej rozdzielczości dostępny na rynku. Nie cierpi również na powolne nagrzewanie spowodowane bezwładnością cieplną (uzyskuje natychmiastowe nagrzewanie w skali milisekundowej) i wykorzystuje wyłącznie dostępne na rynku komponenty. Jedyne nowe obawy związane z bezpieczeństwem wiążą się z obecnością silnych wiązek laserowych (zwykle do 100 mW) wewnątrz urządzenia i ewentualnie przez oczy, co wymaga okularów ochronnych.
Zasada LA-HTM polega na zastosowaniu lasera do lokalnego ogrzewania próbki w polu widzenia mikroskopu (rys. 1a). Aby to zrobić, próbka musi pochłaniać światło. Aby zastosować rozsądną moc lasera (poniżej 100 mW), nie polegaliśmy na absorpcji światła przez ciekły ośrodek, ale sztucznie zwiększaliśmy absorpcję próbki poprzez pokrycie podłoża nanocząsteczkami złota (ryc. 1c). Ogrzewanie nanocząstek złota światłem ma fundamentalne znaczenie w dziedzinie plazmoniki termicznej i spodziewane są zastosowania w biomedycynie, nanochemii lub pozyskiwaniu światła słonecznego29,30,31. W ciągu ostatnich kilku lat używaliśmy LA-HTM w kilku badaniach związanych z zastosowaniami plazmy termicznej w fizyce, chemii i biologii. Główną trudnością związaną z tą metodą jest wyświetlenie końcowego profilu temperatury, ponieważ podwyższona temperatura jest ograniczona do obszaru mikroskali w próbce. Pokazaliśmy, że mapowanie temperatury można uzyskać za pomocą interferometru poprzecznego ścinania o czterech długościach fali, prostej, wysokiej rozdzielczości i bardzo czułej metody ilościowej mikroskopii fazowej opartej na zastosowaniu dwuwymiarowych siatek dyfrakcyjnych (znanych również jako siatki krzyżowe). 33,34,35,36. Niezawodność tej techniki mikroskopii termicznej, opartej na mikroskopii czołowej fali ze skrzyżowaną siatką (CGM), wykazano w kilkunastu artykułach opublikowanych w ciągu ostatniej dekady37,38,39,40,41,42,43.
Schemat instalacji równoległego laserowego mikroskopu nagrzewającego, kształtującego i temperaturowego. b Geometria próbki składająca się z komory AttofluorTM zawierającej szkiełko nakrywkowe pokryte nanocząsteczkami złota. c Przyjrzyj się uważnie próbce (bez zachowania skali). d oznacza jednolity profil wiązki laserowej oraz (e) symulowany późniejszy rozkład temperatury na płaszczyźnie próbki nanocząstek złota. f jest pierścieniowym profilem wiązki laserowej odpowiednim do generowania jednolitej temperatury, jak pokazano w symulacji wynikowego rozkładu temperatury pokazanej w (g). Pasek skali: 30 µm.
W szczególności niedawno osiągnęliśmy ogrzewanie komórek ssaków za pomocą LA-HTM i CGM oraz prześledziliśmy komórkowe reakcje na szok cieplny w zakresie 37–42°C, wykazując możliwość zastosowania tej techniki do obrazowania pojedynczych żywych komórek. Jednakże zastosowanie LA-HTM do badania mikroorganizmów w wysokich temperaturach nie jest jednoznaczne, gdyż wymaga większej ostrożności w porównaniu do komórek ssaków: po pierwsze, podgrzanie dna pożywki o kilkadziesiąt stopni (a nie o kilka stopni) prowadzi do na silny pionowy gradient temperatury. może wytworzyć konwekcję płynu 44, która, jeśli nie jest trwale przymocowana do podłoża, może powodować niepożądany ruch i mieszanie się bakterii. Konwekcję tę można wyeliminować poprzez zmniejszenie grubości warstwy cieczy. W tym celu we wszystkich doświadczeniach przedstawionych poniżej zawiesiny bakteryjne umieszczano pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi o grubości około 15 µm umieszczonymi w metalowym kubku (AttofluorTM, Thermofisher, ryc. 1b,c). Zasadniczo konwekcji można uniknąć, jeśli grubość cieczy jest mniejsza niż wielkość wiązki lasera grzewczego. Po drugie, praca w tak ograniczonej geometrii może udusić organizmy tlenowe (patrz rys. S2). Problemu tego można uniknąć stosując podłoże przepuszczające tlen (lub inny ważny gaz), pozostawiając uwięzione pęcherzyki powietrza wewnątrz szkiełka nakrywkowego lub wiercąc otwory w górnym szkiełku nakrywkowym (patrz rys. S1) 45 . W tym badaniu wybraliśmy to drugie rozwiązanie (ryc. 1b i S1). Wreszcie ogrzewanie laserowe nie zapewnia równomiernego rozkładu temperatury. Nawet przy tym samym natężeniu wiązki lasera (rys. 1d) rozkład temperatury nie jest równomierny, ale raczej przypomina rozkład Gaussa ze względu na dyfuzję cieplną (rys. 1e). Gdy celem jest ustalenie dokładnych temperatur w polu widzenia do badania układów biologicznych, nierówne profile nie są idealne i mogą również prowadzić do termoforetycznego ruchu bakterii, jeśli nie przylegają one do podłoża (patrz rys. S3, S4)39. W tym celu wykorzystaliśmy przestrzenny modulator światła (SLM) do kształtowania wiązki lasera podczerwonego zgodnie z kształtem pierścienia (rys. 1f) w płaszczyźnie próbki, aby uzyskać idealnie równomierny rozkład temperatury w zadanym obszarze geometrycznym, pomimo dyfuzji ciepła (ryc. 1d) 39 , 42, 46. Górne szkiełko nakrywkowe umieścić na metalowym naczyniu (ryc. 1b), aby uniknąć odparowania podłoża i obserwować przez co najmniej kilka dni. Ponieważ górne szkiełko nakrywkowe nie jest szczelnie zamknięte, w razie potrzeby można łatwo dodać dodatkowe podłoże w dowolnym momencie.
Aby zilustrować działanie LA-HTM i wykazać jego przydatność w badaniach termofilnych, zbadaliśmy bakterie tlenowe Geobacillus stearothermophilus, których optymalna temperatura wzrostu wynosi około 60-65°C. Bakteria ma również wici i zdolność pływania, co stanowi kolejny wskaźnik normalnej aktywności komórkowej.
Próbki (ryc. 1b) inkubowano wstępnie w temperaturze 60°C przez godzinę, a następnie umieszczano w uchwycie na próbki LA-HTM. Ta wstępna inkubacja jest opcjonalna, ale nadal użyteczna z dwóch powodów: po pierwsze, gdy laser jest włączony, powoduje natychmiastowy wzrost i podział komórek (patrz film M1 w materiałach uzupełniających). Bez wstępnej inkubacji wzrost bakterii jest zwykle opóźniany o około 40 minut za każdym razem, gdy na próbce podgrzewany jest nowy obszar widzenia. Po drugie, 1-godzinna inkubacja wstępna sprzyjała adhezji bakterii do szkiełka nakrywkowego, zapobiegając dryfowaniu komórek poza polem widzenia w wyniku termoforezy po włączeniu lasera (patrz film M2 w materiałach uzupełniających). Termoforeza to ruch cząstek lub cząsteczek wzdłuż gradientu temperatury, zwykle od gorącej do zimnej, a bakterie nie są tu wyjątkiem43,47. Ten niepożądany efekt jest eliminowany na danym obszarze poprzez zastosowanie SLM do kształtowania wiązki lasera i uzyskania płaskiego rozkładu temperatury.
Na ryc. Ryc. 2 przedstawia rozkład temperatury zmierzony za pomocą CGM uzyskany poprzez napromieniowanie podłoża szklanego pokrytego nanocząsteczkami złota pierścieniową wiązką lasera (ryc. 1f). Zaobserwowano płaski rozkład temperatury na całym obszarze objętym wiązką lasera. Strefę tę ustawiono na 65°C, optymalną temperaturę wzrostu. Poza tym obszarem krzywa temperatury naturalnie opada do \(1/r\) (gdzie \(r\) jest współrzędną promieniową).
a Mapa temperatur pomiarów CGM uzyskana przy użyciu pierścieniowej wiązki lasera do napromieniowania warstwy nanocząstek złota w celu uzyskania płaskiego profilu temperatury na okrągłym obszarze. b Izoterma mapy temperatur (a). Kontur wiązki lasera jest reprezentowany przez szare kropkowane kółko. Eksperyment powtórzono dwukrotnie (patrz Materiały dodatkowe, rysunek S4).
Żywotność komórek bakteryjnych monitorowano przez kilka godzin przy użyciu LA-HTM. Na ryc. 3 pokazuje odstęp czasu dla czterech zdjęć zrobionych z filmu trwającego 3 godziny i 20 minut (film M3, informacje uzupełniające). Zaobserwowano, że bakterie aktywnie namnażają się w okrągłym obszarze wyznaczonym przez laser, gdzie temperatura jest optymalna i zbliża się do 65°C. Natomiast wzrost komórek był znacznie zmniejszony, gdy temperatura spadła poniżej 50°C na 10 sekund.
Obrazy głębi optycznej bakterii G. stearothermophilus rosnących po nagrzaniu laserem w różnym czasie, (a) t = 0 min, (b) 1 godz. 10 min, (c) 2 godz. 20 min, (d) 3 godz. 20 min, poza 200 Wyciągnięte z jednominutowego filmu (film M3 podany w informacjach uzupełniających) nałożonego na odpowiednią mapę temperatur. Laser włącza się w chwili \(t=0\). Do obrazu intensywności dodano izotermy.
Aby dokładniej określić ilościowo wzrost komórek i jego zależność od temperatury, zmierzyliśmy wzrost biomasy różnych kolonii początkowo wyizolowanych bakterii w polu widzenia Movie M3 (ryc. 4). Bakterie macierzyste wybrane na początku tworzenia minijednostek tworzących kolonię (mCFU) pokazano na rysunku S6. Pomiary suchej masy wykonano kamerą CGM 48, która posłużyła do odwzorowania rozkładu temperatury. Zdolność CGM do pomiaru suchej masy i temperatury jest mocną stroną LA-HTM. Zgodnie z oczekiwaniami, wysoka temperatura spowodowała szybszy rozwój bakterii (ryc. 4a). Jak pokazano na wykresie półlogarytmicznym na ryc. 4b, wzrost we wszystkich temperaturach następuje po wzroście wykładniczym, gdzie dane wykorzystują funkcję wykładniczą \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), gdzie \(\tau {{{{\rm{log }}}}}2\) – czas generacji (lub czas podwojenia), \( g =1/ \tau\) – tempo wzrostu (liczba podziałów w jednostce czasu). Na ryc. 4c pokazuje odpowiednią szybkość wzrostu i czas generacji w funkcji temperatury. Szybko rosnące mCFU charakteryzują się nasyceniem wzrostu po dwóch godzinach, co jest oczekiwanym zachowaniem ze względu na dużą gęstość bakterii (podobną do fazy stacjonarnej w klasycznych kulturach płynnych). Ogólny kształt \(g\left(T\right)\) (ryc. 4c) odpowiada oczekiwanej dwufazowej krzywej dla G. stearothermophilus z optymalną szybkością wzrostu około 60-65°C. Dopasuj dane, korzystając z modelu kardynalnego (rysunek S5)49 gdzie \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, co dobrze zgadza się z innymi wartościami cytowanymi w literaturze49. Chociaż parametry zależne od temperatury są powtarzalne, maksymalna szybkość wzrostu \({G}_{0}\) może się różnić w zależności od eksperymentu (patrz rysunki S7-S9 i film M4). W przeciwieństwie do parametrów dopasowania temperaturowego, które powinny być uniwersalne, maksymalna szybkość wzrostu zależy od właściwości podłoża (dostępność składników odżywczych, stężenie tlenu) w obrębie obserwowanej geometrii mikroskali.
Rozwój drobnoustrojów w różnych temperaturach. mCFU: Miniaturowe Jednostki Tworzące Kolonie. Dane uzyskane z filmu przedstawiającego pojedynczą bakterię rosnącą w gradiencie temperatury (film M3). b Podobnie jak w (a), skala półlogarytmiczna. c Tempo wzrostu\(\tau\) i czas generacji\(g\) obliczone z regresji liniowej (b). Poziome słupki błędów: zakres temperatur, w którym mCFU rozszerzyły się w pole widzenia podczas wzrostu. Pionowe słupki błędów: błąd standardowy regresji liniowej.
Oprócz normalnego wzrostu, podczas podgrzewania lasera czasami pojawiają się w polu widzenia niektóre bakterie, co jest zachowaniem oczekiwanym w przypadku bakterii posiadających wici. Film M5 w informacjach dodatkowych przedstawia takie zajęcia pływackie. W tym eksperymencie zastosowano jednolite promieniowanie laserowe do wytworzenia gradientu temperatury, jak pokazano na rysunkach 1d, e i S3. Rycina 5 przedstawia dwie sekwencje obrazów wybrane z filmu M5 pokazujące, że jedna bakteria wykazuje ruch kierunkowy, podczas gdy wszystkie inne bakterie pozostają w bezruchu.
Dwie ramy czasowe (a) i (b) pokazują pływanie dwóch różnych bakterii zaznaczonych kropkowanymi kółkami. Obrazy zostały pobrane z filmu M5 (dostarczonego jako materiał uzupełniający).
W przypadku G. stearothermophilus aktywny ruch bakterii (ryc. 5) rozpoczął się kilka sekund po włączeniu wiązki lasera. Obserwacja ta podkreśla czasową reakcję tego termofilnego mikroorganizmu na wzrost temperatury, jak już zaobserwowali Mora i in. 24 . Temat ruchliwości bakterii, a nawet termotaksji można dalej badać za pomocą LA-HTM.
Pływania drobnoustrojów nie należy mylić z innymi rodzajami ruchu fizycznego, a mianowicie (i) ruchem Browna, który wydaje się ruchem chaotycznym bez określonego kierunku, (ii) konwekcją 50 i termoforezą 43, polegającą na regularnym dryfowaniu ruchu wzdłuż temperatury gradient.
G. stearothermophilus jest znany ze swojej zdolności do wytwarzania wysoce odpornych zarodników (tworzenie się zarodników) pod wpływem niekorzystnych warunków środowiskowych w ramach obrony. Kiedy warunki środowiskowe znów staną się sprzyjające, zarodniki kiełkują, tworząc żywe komórki i wznawiając wzrost. Chociaż ten proces zarodnikowania/kiełkowania jest dobrze znany, nigdy nie zaobserwowano go w czasie rzeczywistym. Stosując LA-HTM, przedstawiamy tutaj pierwszą obserwację zdarzeń kiełkowania u G. stearothermophilus.
Na ryc. 6a przedstawia obrazy poklatkowe głębokości optycznej (OT) uzyskane przy użyciu zestawu CGM składającego się z 13 zarodników. Przez cały czas zbierania (15 h 6 min, \(t=0\) – początek nagrzewania laserowego) wykiełkowały 4 z 13 zarodników, w kolejnych punktach czasowych \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' i \(11\) h \(30\)'. Chociaż tylko jedno z tych zdarzeń pokazano na rycinie 6, w filmie M6 w materiale dodatkowym można zaobserwować 4 zdarzenia kiełkowania. Co ciekawe, kiełkowanie wydaje się przypadkowe: nie wszystkie zarodniki kiełkują i nie kiełkują w tym samym czasie, pomimo tych samych zmian warunków środowiskowych.
a Poklatkowy składający się z 8 obrazów OT (immersja w oleju, obiektyw 60x, 1,25 NA) i (b) ewolucja biomasy agregatów G. stearothermophilus. c (b) Narysowano w skali półlogarytmicznej w celu podkreślenia liniowości tempa wzrostu (linia przerywana).
Na ryc. Ryc. 6b, c przedstawia biomasę populacji komórek w polu widzenia w funkcji czasu w całym okresie gromadzenia danych. Szybki zanik suchej masy obserwowany w \(t=5\)h na ryc. 6b, c, ze względu na wyjście niektórych komórek z pola widzenia. Tempo wzrostu tych czterech zdarzeń wynosi \(0,77\pm 0,1\) h-1. Wartość ta jest wyższa niż szybkość wzrostu pokazana na ryc. 3. 3 i 4, gdzie komórki rosną normalnie. Przyczyna zwiększonego tempa wzrostu G. stearothermophilus z zarodników jest niejasna, ale pomiary te podkreślają zainteresowanie LA-HTM i działają na poziomie pojedynczej komórki (lub na poziomie pojedynczego mCFU), aby dowiedzieć się więcej o dynamice życia komórki .
Aby jeszcze bardziej wykazać wszechstronność LA-HTM i jego działanie w wysokich temperaturach, zbadaliśmy wzrost Sulfolobus shibatae, hipertermofilnego, kwasolubnego archeonów o optymalnej temperaturze wzrostu 80°C51. W porównaniu z G. stearothermophilus te archeony mają również bardzo odmienną morfologię, przypominając raczej 1 mikronowe kulki (cocci) niż wydłużone pręciki (pałeczki).
Ryc. 7a składa się z kolejnych obrazów głębi optycznej S. shibatae mCFU uzyskanych za pomocą CGM (patrz film fabularny M7 w materiałach uzupełniających). Ta mCFU rośnie w temperaturze około 73°C, poniżej optymalnej temperatury 80°C, ale w zakresie temperatur umożliwiającym aktywny wzrost. Zaobserwowaliśmy wiele zdarzeń rozszczepienia, które po kilku godzinach sprawiły, że mCFU wyglądały jak mikrowina archeonów. Na podstawie tych obrazów OT zmierzono biomasę mCFU w czasie i przedstawiono na Ryc. 7b. Co ciekawe, mCFU S. shibatae wykazywały wzrost liniowy, a nie wykładniczy wzrost obserwowany w przypadku mCFU G. stearothermophilus. Od dawna toczy się dyskusja 52 na temat natury tempa wzrostu komórek: podczas gdy niektóre badania wskazują na tempo wzrostu drobnoustrojów proporcjonalne do ich wielkości (wzrost wykładniczy), inne wykazują stałe tempo (wzrost liniowy lub dwuliniowy). Jak wyjaśnili Tzur i wsp.53, rozróżnienie wzrostu wykładniczego i (dwu)liniowego wymaga precyzji pomiarów biomasy <6%, która jest poza zasięgiem większości technik QPM, nawet obejmujących interferometrię. Jak wyjaśnili Tzur i wsp.53, rozróżnienie wzrostu wykładniczego i (dwu)liniowego wymaga precyzji pomiarów biomasy <6%, która jest poza zasięgiem większości technik QPM, nawet obejmujących interferometrię. Как объяснили Цур i др.53, различение экспоненциального i (би)линейного роста требует точности <6% в измерени ях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием inтерферометрии. Jak wyjaśnili Zur i wsp.53, rozróżnienie wzrostu wykładniczego i (bi)liniowego wymaga dokładności pomiarów biomasy <6%, co jest nieosiągalne w przypadku większości metod QPM, nawet przy użyciu interferometrii.Jak wyjaśnili Zur i in. 53, rozróżnienie wzrostu wykładniczego i (bi)liniowego wymaga mniej niż 6% dokładności pomiarów biomasy, co jest nieosiągalne w przypadku większości metod QPM, nawet przy zastosowaniu interferometrii. CGM osiąga tę dokładność z dokładnością poniżej pg w pomiarach biomasy36,48.
a Poklatkowy składający się z 6 obrazów OT (zanurzenie w oleju, 60x, obiektyw NA 1,25) i (b) ewolucja biomasy mikro-CFU mierzona za pomocą CGM. Więcej informacji można znaleźć w filmie M7.
Doskonale liniowy wzrost S. shibatae był nieoczekiwany i nie został jeszcze opisany. Jednakże oczekuje się wykładniczego wzrostu, przynajmniej dlatego, że z biegiem czasu muszą nastąpić wielokrotne podziały 2, 4, 8, 16… komórek. Postawiliśmy hipotezę, że wzrost liniowy może wynikać z hamowania komórek z powodu gęstego upakowania komórek, podobnie jak wzrost komórek spowalnia i ostatecznie osiąga stan uśpienia, gdy gęstość komórek jest zbyt duża.
Kończymy, omawiając kolejno pięć następujących punktów zainteresowania: zmniejszenie objętości ogrzewania, zmniejszenie bezwładności cieplnej, zainteresowanie nanocząsteczkami złota, zainteresowanie ilościową mikroskopią fazową i możliwy zakres temperatur, w którym można zastosować LA-HTM.
W porównaniu z ogrzewaniem rezystancyjnym, ogrzewanie laserowe stosowane do opracowywania HTM ma kilka zalet, które ilustrujemy w tym badaniu. W szczególności w ośrodkach ciekłych w polu widzenia mikroskopu objętość ogrzewania utrzymuje się w granicach kilku (10 µm) 3 objętości. W ten sposób aktywne są tylko zaobserwowane drobnoustroje, inne zaś pozostają w stanie uśpionym i można je wykorzystać do dalszych badań próbki – nie ma konieczności zmiany próbki za każdym razem, gdy trzeba sprawdzić nową temperaturę. Dodatkowo ogrzewanie w mikroskali umożliwia bezpośrednie badanie dużego zakresu temperatur: Rysunek 4c uzyskano z 3-godzinnego filmu (Film M3), który zwykle wymaga przygotowania i zbadania kilku próbek – po jednej dla każdej z badanych próbek. y to temperatura reprezentująca liczbę dni eksperymentu. Zmniejszenie podgrzewanej objętości powoduje również, że wszystkie otaczające elementy optyczne mikroskopu, zwłaszcza soczewka obiektywu, pozostają w temperaturze pokojowej, co dotychczas stanowiło główny problem, z którym borykała się społeczność. LA-HTM można używać z dowolnym obiektywem, w tym z soczewkami immersyjnymi, i pozostaje w temperaturze pokojowej nawet przy ekstremalnych temperaturach w polu widzenia. Głównym ograniczeniem metody ogrzewania laserowego, o którym informujemy w tym badaniu, jest to, że komórki, które nie przylegają lub nie unoszą się na wodzie, mogą znajdować się daleko od pola widzenia i być trudne do zbadania. Rozwiązaniem mogłoby być zastosowanie soczewek o małym powiększeniu, aby osiągnąć większy wzrost temperatury przekraczający kilkaset mikronów. Ostrożności tej towarzyszy zmniejszenie rozdzielczości przestrzennej, ale jeśli celem jest badanie ruchu mikroorganizmów, wysoka rozdzielczość przestrzenna nie jest wymagana.
Skala czasowa ogrzewania (i chłodzenia) systemu \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{\mbox{D}}}}\) zależy od jego wielkości, zgodnie z prawem \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), gdzie \ (L\ ) to charakterystyczna wielkość źródła ciepła (średnica wiązki lasera w naszych badaniach wynosi \(L\ około 100\) μm), \(D\) to dyfuzyjność cieplna otoczenia (średnia w naszym obudowa, szkło i woda Szybkość dyfuzji\(D\ około 2\krotność {10}^{-7}\) m2/s). Dlatego w tym badaniu czas reakcji jest rzędu 50 ms, tj. quasi-natychmiastowy. można się spodziewać zmian temperatury. To natychmiastowe ustalenie wzrostu temperatury nie tylko skraca czas trwania eksperymentu, ale także umożliwia precyzyjne określenie czasu (t=0) dla dowolnego dynamicznego badania skutków temperatury.
Proponowaną przez nas metodę można zastosować do dowolnego podłoża pochłaniającego światło (na przykład próbek handlowych z powłoką ITO). Jednakże nanocząstki złota są w stanie zapewnić wysoką absorpcję w podczerwieni i niską absorpcję w zakresie widzialnym, co jest istotne dla skutecznej obserwacji optycznej w zakresie widzialnym, zwłaszcza przy zastosowaniu fluorescencji. Ponadto złoto jest biokompatybilne, chemicznie obojętne, gęstość optyczną można regulować w zakresie od 530 nm do bliskiej podczerwieni, a przygotowanie próbki jest proste i ekonomiczne29.
Mikroskopia poprzeczna siatkowa (CGM) umożliwia nie tylko mapowanie temperatury w mikroskali, ale także monitorowanie biomasy, co czyni ją szczególnie przydatną (jeśli nie jest to konieczne) w połączeniu z LA-HTM. W ciągu ostatniej dekady rozwinęły się inne techniki mikroskopii temperaturowej, zwłaszcza w dziedzinie bioobrazowania, a większość z nich wymaga stosowania termoczułych sond fluorescencyjnych54,55. Jednakże metody te były krytykowane, a w niektórych raportach zmierzono nierealistyczne zmiany temperatury w komórkach, prawdopodobnie ze względu na fakt, że fluorescencja zależy od wielu czynników innych niż temperatura. Ponadto większość sond fluorescencyjnych jest niestabilna w wysokich temperaturach. Dlatego QPM, a w szczególności CGM, stanowią idealną technikę mikroskopii temperaturowej do badania życia w wysokich temperaturach za pomocą mikroskopii optycznej.
Badania S. shibatae, które optymalnie żyją w temperaturze 80°C, pokazują, że LA-HTM można zastosować do badania hipertermofilów, a nie tylko prostych termofilów. Zasadniczo nie ma ograniczeń co do zakresu temperatur, które można osiągnąć przy użyciu LA-HTM, a nawet temperatury powyżej 100°C można osiągnąć pod ciśnieniem atmosferycznym bez wrzenia, co wykazała nasza grupa 38 osób zajmujących się zastosowaniami chemii hydrotermalnej w warunkach atmosferycznych ciśnienie A. W ten sam sposób do ogrzewania nanocząstek złota 40 wykorzystuje się laser. Zatem LA-HTM ma potencjał do wykorzystania do obserwacji niespotykanych hipertermofilów za pomocą standardowej mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości w standardowych warunkach (tj. pod wpływem stresu środowiskowego).
Wszystkie doświadczenia przeprowadzono przy użyciu domowego mikroskopu, wyposażonego w oświetlenie Köhlera (z diodami LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), uchwyt na próbki z ręcznym ruchem XY, obiektywy (Olympus, 60x, 0,7 NA, powietrze, LUCPlanFLN60X lub 60x, 1,25 NA, olej , UPLFLN60XOI), kamera CGM (siatka krzyżowa QLSI, podziałka 39 µm, 0,87 mm od czujnika kamery Andor Zyla) do zapewnienia obrazowania intensywności i czoła fali oraz kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, tryb 16-bitowy, firmy Hamamatsu) do nagrywania dane pokazane na ryc. 5 (pływanie bakterii). Dichroiczny rozdzielacz wiązki to 749 nm BrightLine Edge (Semrock, FF749-SDi01). Filtr umieszczony z przodu aparatu to filtr krótkoprzepustowy 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Tytanowo-szafirowy laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pompowana wnęka lasera tsunami, Spectra-Physics na ryc. 2-5, dodatkowo zastąpiony laserem Millenia, Spectraphysics 10 W, pompowana wnęka lasera Mira, Coherent, dla ryc. 2 -5). 6 i 7) są ustawione na długość fali \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, która odpowiada widmu rezonansu plazmonowego nanocząstek złota.Przestrzenne modulatory światła (1920 × 1152 pikseli) zakupiono od Meadowlark Optics. Hologramy obliczono przy użyciu algorytmu Gerchberga-Saxtona, jak opisano w linku 39.
Mikroskopia czołowa fali krzyżowej (CGM) to technika mikroskopii optycznej oparta na połączeniu dwuwymiarowej siatki dyfrakcyjnej (znanej również jako siatka krzyżowa) w odległości jednego milimetra od czujnika konwencjonalnej kamery. Najczęstszym przykładem CGM, którego użyliśmy w tym badaniu, jest interferometr z przesunięciem poprzecznym o czterech długościach fali (QLSI), w którym siatka krzyżowa składa się ze wzoru szachownicy intensywności/fazy wprowadzonego i opatentowanego przez Primota i in. w 200034. Pionowe i poziome linie siatki tworzą na czujniku cienie przypominające siatkę, których zniekształcenie można przetwarzać numerycznie w czasie rzeczywistym w celu uzyskania optycznego zniekształcenia czoła fali (lub równoważnego profilu fazowego) padającego światła. Kamera CGM używana pod mikroskopem może wyświetlać różnicę ścieżki optycznej obrazowanego obiektu, zwaną także głębią optyczną (OT), z czułością rzędu nanometrów36. W przypadku każdego pomiaru CGM, aby wyeliminować wszelkie defekty elementów optycznych lub wiązek, należy wykonać główny obraz referencyjny OT i odjąć go od kolejnych obrazów.
Mikroskopię temperaturową przeprowadzono przy użyciu kamery CGM, jak opisano w odnośniku. 32. Krótko mówiąc, ogrzewanie cieczy zmienia jej współczynnik załamania światła, tworząc efekt soczewki termicznej, który zniekształca padającą wiązkę. To zniekształcenie czoła fali jest mierzone przez CGM i przetwarzane przy użyciu algorytmu dekonwolucji w celu uzyskania trójwymiarowego rozkładu temperatury w ciekłym ośrodku. Jeśli nanocząstki złota są równomiernie rozmieszczone w próbce, można wykonać mapowanie temperatury w obszarach wolnych od bakterii, aby uzyskać lepsze obrazy, co czasami robimy. Referencyjny obraz CGM uzyskano bez podgrzewania (przy wyłączonym laserze), a następnie zarejestrowano w tym samym miejscu obrazu przy włączonym laserze.
Pomiar suchej masy odbywa się przy użyciu tej samej kamery CGM, która jest używana do obrazowania temperatury. Obrazy referencyjne CGM uzyskano poprzez szybkie przesuwanie próbki w osiach x i y podczas ekspozycji, w celu uśrednienia wszelkich niejednorodności w OT spowodowanych obecnością bakterii. Z obrazów OT bakterii uzyskano ich biomasę za pomocą zestawu obrazów obszarów wybranych przy użyciu domowego algorytmu segmentacji Matlaba (patrz podrozdział „Kod numeryczny”), zgodnie z procedurą opisaną w ref. 48. Krótko mówiąc, używamy relacji \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), gdzie \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) to obraz głębi optycznej, \(m\) to sucha masa i \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) jest stałą. Wybraliśmy \({{{\rm{\alpha)}))))=0,18\) µm3/pg, co jest typową stałą dla żywych komórek.
Szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm i grubości 150 µm pokryte nanocząsteczkami złota umieszczono w komorze AttofluorTM (Thermofisher) nanocząsteczkami złota skierowanymi do góry. Geobacillus stearothermophilus hodowano wstępnie przez noc w pożywce LB (200 obr./min., 60°C) przed każdym dniem doświadczeń. Kroplę 5 µl zawiesiny G. stearothermophilus o gęstości optycznej (OD) od 0,3 do 0,5 umieszczono na szkiełku nakrywkowym zawierającym nanocząsteczki złota. Następnie na kroplę wrzucono okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm z otworem o średnicy 5 mm w środku i na środek otworu wielokrotnie naniesiono 5 µl zawiesiny bakteryjnej o tej samej gęstości optycznej. Dołki na szkiełkach nakrywkowych przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w ref. 45 (więcej informacji można znaleźć w informacjach uzupełniających). Następnie dodać 1 ml podłoża LB do szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec wysychaniu płynnej warstwy. Ostatnie szkiełko nakrywkowe umieszcza się na zamkniętej pokrywie komory Attofluor™, aby zapobiec parowaniu podłoża podczas inkubacji. Do eksperymentów z kiełkowaniem używaliśmy zarodników, które po konwencjonalnych eksperymentach czasami pokrywały górne szkiełko nakrywkowe. W podobny sposób uzyskano Sulfolobus shibatae. Prowadzono trzy dni (200 obr./min., 75°C) wstępnej hodowli Thiobacillus serrata w pożywce 182 (DSMZ).
Próbki nanocząstek złota przygotowano metodą litografii micelarnej na kopolimerach blokowych. Proces ten opisano szczegółowo w rozdz. 60. W skrócie, micele kapsułkujące jony złota zsyntetyzowano przez zmieszanie kopolimeru z HAuCl4 w toluenie. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe następnie zanurzono w roztworze i poddano działaniu promieniowania UV w obecności środka redukującego w celu uzyskania ziaren złota. Na koniec wyhodowano nasiona złota poprzez kontakt szkiełka nakrywkowego z wodnym roztworem KAuCl4 i etanoloaminy na 16 minut, co spowodowało quasi-okresowe i bardzo równomierne rozmieszczenie niesferycznych nanocząstek złota w bliskiej podczerwieni.
Aby przekonwertować interferogramy na obrazy OT, użyliśmy domowego algorytmu, jak opisano szczegółowo w linku. 33 i jest dostępny jako pakiet Matlab w następującym publicznym repozytorium: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pakiet umożliwia obliczanie obrazów intensywności i OT na podstawie zarejestrowanych interferogramów (w tym obrazów referencyjnych) i odległości układu kamer.
Aby obliczyć wzór fazowy zastosowany do SLM w celu uzyskania danego profilu temperaturowego, wykorzystaliśmy wcześniej opracowany domowy algorytm39,42, który jest dostępny w następującym publicznym repozytorium: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Dane wejściowe to żądane pole temperatury, które można ustawić cyfrowo lub za pomocą monochromatycznego obrazu bmp.
Do segmentacji komórek i pomiaru ich suchej masy wykorzystaliśmy nasz algorytm Matlab opublikowany w publicznym repozytorium: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Na każdym obrazie użytkownik musi kliknąć interesującą nas bakterię lub mCFU, dostosować czułość różdżki i potwierdzić wybór.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu raportu z badań przyrodniczych, do którego link znajduje się w tym artykule.
Dane potwierdzające wyniki tego badania są dostępne u odpowiednich autorów na uzasadnione żądanie.
Kod źródłowy wykorzystany w tym badaniu opisano szczegółowo w sekcji Metody, a wersje debugujące można pobrać z https://github.com/baffou/ w następujących repozytoriach: SLM_temperatureShaping, CGMprocess i CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Wgląd w termofile i ich zastosowania o szerokim spektrum działania. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Wgląd w termofile i ich zastosowania o szerokim spektrum działania.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Przegląd termofilów i ich szerokie zastosowanie. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. i Sharma AK Głębokie zrozumienie termofilów i szeroki zakres zastosowań.3 Biotechnologia 6, 81 (2016).
Czas publikacji: 26 września 2022 r