Kompleksowa proteomika odkrywa biomarkery płynu mózgowo-rdzeniowego w bezobjawowej i objawowej chorobie Alzheimera

W chorobie Alzheimera (AD) brakuje biomarkerów białkowych, które odzwierciedlają jej złożoną patofizjologię, co utrudnia postęp w diagnostyce i leczeniu. W tym przypadku wykorzystujemy wszechstronną proteomikę do identyfikacji biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), które reprezentują szeroki zakres patofizjologii AD. Multipleksowa spektrometria mas zidentyfikowała odpowiednio około 3500 i około 12 000 białek w płynie mózgowo-rdzeniowym AD i mózgu. Analiza sieci proteomu mózgu pozwoliła zidentyfikować 44 moduły różnorodności biologicznej, z których 15 pokrywało się z proteomem płynu mózgowo-rdzeniowego. Markery AD w płynie mózgowo-rdzeniowym w tych nakładających się modułach są złożone w pięć grup białek, reprezentujących różne procesy patofizjologiczne. Liczba synaps i metabolitów w mózgu osób chorych na AD zmniejsza się, ale zwiększa się ilość płynu mózgowo-rdzeniowego, podczas gdy wzrasta ilość mielinizacji i grup odpornościowych bogatych w glej w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym. Konsystencja i specyficzność chorobowa zmian panelu zostały potwierdzone w ponad 500 dodatkowych próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego. Grupy te zidentyfikowały także podgrupy biologiczne w bezobjawowej chorobie Alzheimera. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te stanowią obiecujący krok w kierunku internetowych narzędzi do tworzenia biomarkerów do zastosowań klinicznych w leczeniu AD.
Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą przyczyną otępienia neurodegeneracyjnego na świecie i charakteryzuje się szerokim zakresem dysfunkcji układu biologicznego, w tym transmisji synaptycznej, odporności za pośrednictwem glejów i metabolizmu mitochondriów (1-3). Jednak ustalone biomarkery białkowe w dalszym ciągu koncentrują się na wykrywaniu białka amyloidu i tau, a zatem nie mogą odzwierciedlać tej zróżnicowanej patofizjologii. Te „rdzeniowe” biomarkery białkowe, które najpewniej oznacza się w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), obejmują (i) peptyd beta amyloidu 1-42 (Aβ1-42), który odzwierciedla tworzenie korowych płytek amyloidowych; (ii) całkowite tau, oznaka zwyrodnienia aksonu; (iii) fosfo-tau (p-tau), przedstawiciel patologicznej hiperfosforylacji tau (4-7). Chociaż te biomarkery płynu mózgowo-rdzeniowego znacznie ułatwiły wykrywanie „wyraźnych” chorób białkowych AD (4-7), reprezentują one jedynie niewielką część złożonej biologii stojącej za chorobą.
Brak różnorodności patofizjologicznej biomarkerów AD doprowadził do wielu wyzwań, w tym (i) niemożności identyfikacji i ilościowego określenia różnorodności biologicznej pacjentów z AD, (ii) niewystarczającego pomiaru ciężkości i postępu choroby, szczególnie w fazie przedklinicznej oraz ( iii) opracowanie leków terapeutycznych, które nie rozwiązały całkowicie wszystkich aspektów pogorszenia stanu neurologicznego. Nasze poleganie na przełomowych patologiach przy opisywaniu choroby Alzheimera na tle chorób pokrewnych tylko pogłębia te problemy. Coraz więcej dowodów wskazuje, że większość starszych osób z demencją ma więcej niż jedną patologiczną cechę pogorszenia funkcji poznawczych (8). Aż 90% lub więcej osób z patologią AD cierpi również na chorobę naczyniową, wtręty TDP-43 lub inne choroby zwyrodnieniowe (9). Te wysokie proporcje nakładania się patologii zakłóciły nasze obecne ramy diagnostyczne dla demencji i potrzebna jest bardziej wszechstronna patofizjologiczna definicja choroby.
Ze względu na pilne zapotrzebowanie na różnorodne biomarkery AD, w tej dziedzinie coraz częściej stosuje się metodę „omiki” opartą na ogólnym systemie odkrywania biomarkerów. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance zostało założone w 2014 roku i stanowi awangardę programu. Celem tego wielodyscyplinarnego wysiłku Narodowego Instytutu Zdrowia, środowiska akademickiego i przemysłu jest wykorzystanie strategii systemowych w celu lepszego zdefiniowania patofizjologii choroby Alzheimera oraz opracowania analizy diagnostycznej różnorodności biologicznej i strategii leczenia (10). W ramach tego projektu proteomika sieciowa stała się obiecującym narzędziem do rozwoju biomarkerów systemowych w chorobie Alzheimera. To bezstronne podejście oparte na danych organizuje złożone zbiory danych proteomicznych w grupy lub „moduły” białek ulegających wspólnej ekspresji, które są powiązane z określonymi typami komórek, organellami i funkcjami biologicznymi (11-13). Przeprowadzono prawie 12 bogatych w informacje badań proteomiki sieciowej dotyczących mózgu osób cierpiących na AD (13-23). Ogólnie rzecz biorąc, analizy te wskazują, że proteom sieci mózgu AD utrzymuje wysoce konserwatywną organizację modułową w niezależnych kohortach i wielu obszarach korowych. Ponadto niektóre z tych modułów wykazują powtarzalne zmiany w częstości występowania AD w różnych zestawach danych, odzwierciedlając patofizjologię wielu chorób. Łącznie odkrycia te stanowią obiecujący punkt zaczepienia dla odkrycia proteomu sieci mózgowej jako biomarkera systemowego w chorobie Alzheimera.
Aby przekształcić proteom sieci mózgowej AD w klinicznie przydatne biomarkery systemowe, połączyliśmy sieć pochodzącą z mózgu z analizą proteomiczną CSF AD. To zintegrowane podejście doprowadziło do identyfikacji pięciu obiecujących zestawów biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego, które są powiązane z szerokim zakresem patofizjologii mózgu, w tym z synapsami, naczyniami krwionośnymi, mielinizacją, stanem zapalnym i dysfunkcją szlaków metabolicznych. Pomyślnie zweryfikowaliśmy te panele biomarkerów poprzez wielokrotne analizy replikacji, w tym ponad 500 próbek płynu mózgowo-rdzeniowego pochodzących z różnych chorób neurodegeneracyjnych. Te analizy walidacyjne obejmują badanie docelowych grup w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z bezobjawową chorobą Alzheimera (AsymAD) lub wykazanie dowodów na nieprawidłową akumulację amyloidu w normalnym środowisku poznawczym. Analizy te podkreślają znaczną różnorodność biologiczną w populacji AsymAD i identyfikują markery panelowe, które mogą umożliwiać podtyp osobników w najwcześniejszych stadiach choroby. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te stanowią kluczowy krok w rozwoju narzędzi do oznaczania biomarkerów białkowych opartych na wielu systemach, które mogą z powodzeniem rozwiązać wiele problemów klinicznych stojących przed chorobą Alzheimera.
Głównym celem tego badania jest identyfikacja nowych biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego, które odzwierciedlają różne patofizjologie mózgu prowadzące do choroby Alzheimera. Rysunek S1 przedstawia naszą metodologię badawczą, która obejmuje (i) wszechstronną analizę opartą na wstępnych ustaleniach AD CSF i sieciowego proteomu mózgu w celu zidentyfikowania wielu biomarkerów chorób CSF związanych z mózgiem oraz (ii) późniejszą replikację. Te biomarkery znajdują się w kilku niezależnych mózgowo-rdzeniowych płynne kohorty. Badania ukierunkowane na odkrycia rozpoczęły się od analizy zróżnicowanej ekspresji płynu mózgowo-rdzeniowego u 20 osób z prawidłowymi funkcjami poznawczymi i 20 pacjentów z AD w Centrum Badań nad Chorobą Alzheimera Emory Goizueta (ADRC). Rozpoznanie AD definiuje się jako istotne upośledzenie funkcji poznawczych przy niskim stężeniu Aβ1-42 i podwyższonych poziomach całkowitego tau i p-tau w płynie mózgowo-rdzeniowym [średnia montrealska ocena poznawcza (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabela S1A). Kontrola (średnia MoCA, 26,7 ± 2,2) miała prawidłowy poziom biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego.
Ludzki płyn mózgowo-rdzeniowy charakteryzuje się dynamicznym zakresem obfitości białka, w którym albumina i inne niezwykle obfite białka mogą uniemożliwić wykrycie białek będących przedmiotem zainteresowania (24). Aby zwiększyć głębokość odkrywania białek, usunęliśmy pierwsze 14 białek w dużej liczbie z każdej próbki płynu mózgowo-rdzeniowego przed analizą spektrometrią mas (MS) (24). Za pomocą MS zidentyfikowano łącznie 39 805 peptydów, które zmapowano na 3691 proteomach w 40 próbkach. Ilościowe oznaczenie białka przeprowadza się za pomocą wielokrotnego znakowania tandemowego znacznika masy (TMT) (18, 25). Aby uzupełnić brakujące dane, uwzględniliśmy tylko te białka, które w kolejnej analizie oznaczono ilościowo w co najmniej 50% próbek, ostatecznie określając ilościowo 2875 proteomów. Ze względu na znaczącą różnicę w poziomach całkowitej zawartości białka, próbę kontrolną uznano statystycznie za wartość odstającą (13) i nie uwzględniono jej w późniejszej analizie. Wartości liczebności pozostałych 39 próbek dostosowano w zależności od wieku, płci i kowariancji partii (13-15, 17, 18, 20, 26).
Wykorzystując statystyczną analizę testu t do oceny zróżnicowanej ekspresji w zestawie danych regresji, analiza ta zidentyfikowała białka, których poziomy liczebności uległy istotnej zmianie (P <0,05) pomiędzy przypadkami kontrolnymi i przypadkami AD (Tabela S2A). Jak pokazano na rycinie 1A, liczebność łącznie 225 białek w AD została znacząco zmniejszona, a liczebność 303 białek znacznie wzrosła. Te białka ulegające zróżnicowanej ekspresji obejmują kilka wcześniej zidentyfikowanych markerów AD płynu mózgowo-rdzeniowego, takich jak białko tau związane z mikrotubulami (MAPT; P = 3,52 × 10-8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10-3), białko związane ze wzrostem 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), białko wiążące kwasy tłuszczowe 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), chitynaza 3 podobna do 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), granulina neuronowa (NRGN; P = 3,43 × 10−4) i czynnik wzrostu nerwów VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Jednakże zidentyfikowaliśmy również inne bardzo ważne cele, takie jak inhibitor dysocjacji PKB 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) i modułowe wiązanie wapnia związane ze SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Analiza Gene Ontology (GO) 225 znacząco zredukowanych białek ujawniła ścisłe powiązania z procesami płynów ustrojowych, takimi jak metabolizm steroidów, krzepnięcie krwi i aktywność hormonalna (Rysunek 1B i Tabela S2B). Natomiast znacznie zwiększone białko 303 jest ściśle związane ze strukturą komórkową i metabolizmem energetycznym.
(A) Wykres wulkanu przedstawia log2-krotną zmianę (oś x) w stosunku do statystycznej wartości P -log10 (oś y) uzyskanej w teście t, który jest używany do wykrycia różnicy ekspresji pomiędzy kontrolą (CT) i Przypadki AD proteomu CSF ze wszystkich białek. Białka o znacznie obniżonym poziomie (P <0,05) w AD pokazano na niebiesko, podczas gdy białka o znacznie podwyższonym poziomie w chorobie pokazano na czerwono. Wybrane białko jest oznakowane. (B) Najpopularniejsze terminy GO związane z białkiem są znacznie zmniejszone (kolor niebieski) i zwiększone (kolor czerwony) w AD. Pokazuje trzy terminy GO z najwyższymi wynikami z w dziedzinie procesów biologicznych, funkcji molekularnych i składników komórkowych. (C) MS zmierzyło poziom MAPT w próbce płynu mózgowo-rdzeniowego (po lewej) i jego korelację z poziomem tau w próbce ELISA (po prawej). Wyświetlany jest współczynnik korelacji Pearsona z odpowiednią wartością P. Ze względu na brak danych ELISA dla jednego przypadku AD, liczby te obejmują wartości dla 38 z 39 analizowanych przypadków. (D) Nadzorowana analiza skupień (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) skorygowana P <0,01) w kontroli i AD CSF znalazła próbki wykorzystujące 65 najbardziej znacząco zmienionych białek w zestawie danych. Standaryzuj, normalizuj.
Poziom proteomiczny MAPT jest ściśle powiązany z niezależnie mierzonym poziomem tau w teście ELISA (r = 0, 78, P = 7, 8 × 10-9; Ryc. 1C), co potwierdza ważność naszego pomiaru MS. Po trawieniu trypsyną na poziomie białka prekursorowego amyloidu (APP), peptydy specyficzne dla izoform zmapowane na C-końcu Aβ1-40 i Aβ1-42 nie mogą być skutecznie jonizowane (27, 28). Zatem zidentyfikowane przez nas peptydy APP nie mają nic wspólnego z poziomami Aβ1-42 w teście ELISA. Aby ocenić zróżnicowaną ekspresję w każdym przypadku, zastosowaliśmy białka o różnej ekspresji z P <0, 0001 [współczynnik fałszywego odkrycia (FDR) skorygowany P <0, 01], aby przeprowadzić nadzorowaną analizę skupień próbek (tabela S2A). Jak pokazano na rycinie 1D, tych 65 wysoce znaczących białek może prawidłowo grupować próbki według stanu chorobowego, z wyjątkiem jednego przypadku AD o charakterystyce kontrolnej. Spośród tych 65 białek, 63 zwiększyło się w przypadku AD, podczas gdy tylko dwa (CD74 i ISLR) uległy zmniejszeniu. W sumie analizy płynu mózgowo-rdzeniowego pozwoliły zidentyfikować setki białek występujących w chorobie Alzheimera, które mogą służyć jako biomarkery choroby.
Następnie przeprowadziliśmy niezależną analizę sieciową proteomu mózgu AD. Kohorta mózgów objęta tym odkryciem obejmowała grzbietowo-boczną korę przedczołową (DLPFC) z grupy kontrolnej (n = 10), choroby Parkinsona (PD; n = 10), mieszanej AD/PD (n = 10) i AD (n = 10). ) Próbka. Emery Goizueta ADRC. Dane demograficzne tych 40 przypadków opisano wcześniej (25) i podsumowano w tabeli S1B. Wykorzystaliśmy TMT-MS do analizy 40 tkanek mózgowych i kohorty replikacyjnej 27 przypadków. W sumie te dwa zestawy danych mózgowych wytworzyły 227 121 unikalnych peptydów, które zmapowano na 12 943 proteomach (25). Do kolejnych badań włączono jedynie te białka, które oznaczono ilościowo w co najmniej 50% przypadków. Ostateczny zestaw danych odkrycia zawiera 8817 białek określonych ilościowo. Dostosuj poziom obfitości białka w oparciu o wiek, płeć i okres pośmiertny (PMI). Analiza ekspresji różnicowej zbioru danych po regresji wykazała, że ​​poziomy białka >2000 uległy istotnej zmianie [P <0,05, analiza wariancji (ANOVA)] w dwóch lub więcej kohortach chorób. Następnie przeprowadziliśmy nadzorowaną analizę skupień w oparciu o białka o różnej ekspresji i P <0,0001 w porównaniach AD/kontrola i/lub AD/PD (rysunek S2, A i B, tabela S2C). Te 165 wysoce zmienionych białek wyraźnie przedstawia przypadki z patologią AD z próbek kontrolnych i PD, potwierdzając silne zmiany specyficzne dla AD w całym proteomie.
Następnie użyliśmy algorytmu zwanego analizą sieci koekspresji ważonych genów (WGCNA), aby przeprowadzić analizę sieci odkrytego proteomu mózgu, która organizuje zestaw danych w moduły białkowe o podobnych wzorach ekspresji (11-13). W analizie zidentyfikowano 44 moduły (M) białek ulegających koekspresji, posortowanych i ponumerowanych od największego (M1, n = 1821 białek) do najmniejszego (M44, n = 34 białka) (Rysunek 2A i Tabela S2D)). Jak wspomniano powyżej (13) Obliczyć reprezentatywny profil ekspresji lub charakterystyczne białko każdego modułu i skorelować go ze stanem chorobowym i patologią AD, to znaczy ustalić połączenie rejestru choroby Alzheimera (CERAD) i wyniku Braak (Rysunek 2B). Ogółem 17 modułów było istotnie powiązanych z neuropatologią AD (p <0,05). Wiele z tych modułów związanych z chorobą jest również bogatych w markery specyficzne dla typu komórki (ryc. 2B). Jak wspomniano powyżej (13), wzbogacenie typu komórki określa się poprzez analizę nakładania się modułów i listę referencyjną genów specyficznych dla typu komórki. Geny te pochodzą z opublikowanych danych dotyczących izolowanych neuronów myszy, komórek śródbłonka i glejów. Eksperyment z sekwencjonowaniem RNA (seq RNA) (29).
(A) Odkryj WGCNA proteomu mózgu. (B) Analiza średniej korelacji dwumasowej (BiCor) modułowego białka sygnaturowego (pierwszego głównego składnika modułowej ekspresji białka) z charakterystyką neuropatologiczną AD (na górze), w tym punktacją CERAD (płytka Aβ) i Braak (splątki tau). Intensywność korelacji dodatniej (czerwonej) i ujemnej (niebieskiej) pokazano na dwukolorowej mapie cieplnej, a gwiazdki wskazują istotność statystyczną (P <0,05). Użyj dokładnego testu hipergeometrycznego Fishera (FET) (na dole), aby ocenić powiązanie typu komórkowego każdego modułu białkowego. Intensywność czerwonego cieniowania wskazuje stopień wzbogacenia typu komórek, a gwiazdka oznacza istotność statystyczną (P <0,05). Użyj metody BH, aby skorygować wartość P uzyskaną z FET. (C) Analiza GO białek modułowych. Dla każdego modułu lub powiązanej grupy modułów pokazano najbardziej powiązane procesy biologiczne. oligo, oligodendrocyt.
Zestaw pięciu blisko spokrewnionych modułów bogatych w astrocyty i mikroglej (M30, M29, M18, M24 i M5) wykazał silną dodatnią korelację z neuropatologią AD (ryc. 2B). Analiza ontologiczna łączy te moduły glejowe ze wzrostem, proliferacją i odpornością komórek (ryc. 2C i tabela S2E). Dwa dodatkowe moduły glejowe, M8 i M22, są również silnie zwiększone w chorobie. M8 jest silnie powiązany ze szlakiem receptora Toll-podobnego, kaskadą sygnalizacyjną, która odgrywa kluczową rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej (30). Jednocześnie M22 jest ściśle powiązany z modyfikacją potranslacyjną. Bogaty w oligodendrocyty M2 wykazuje silną dodatnią korelację z patologią AD oraz związek ontologiczny z syntezą nukleozydów i replikacją DNA, co wskazuje na wzmożoną proliferację komórek w chorobach. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia te potwierdzają podniesienie poziomu modułów glejowych, które zaobserwowaliśmy wcześniej w proteomie sieci AD (13, 17). Obecnie stwierdzono, że wiele modułów glejowych związanych z AD w sieci wykazuje niższy poziom ekspresji w przypadkach kontrolnych i PD, co podkreśla ich specyficzność chorobową, która jest podwyższona w AD (Rysunek S2C).
Tylko cztery moduły w naszym proteomie sieciowym (M1, M3, M10 i M32) są silnie ujemnie skorelowane z patologią AD (P <0,05) (ryc. 2, B i C). Zarówno M1, jak i M3 są bogate w markery neuronalne. M1 jest ściśle powiązany z sygnałami synaptycznymi, podczas gdy M3 jest ściśle powiązany z funkcją mitochondriów. Nie ma dowodów na wzbogacenie typów komórek w M10 i M32. M32 odzwierciedla związek między M3 a metabolizmem komórkowym, podczas gdy M10 jest silnie powiązany ze wzrostem komórek i funkcją mikrotubul. W porównaniu z AD, wszystkie cztery moduły mają zwiększoną kontrolę i PD, co powoduje zmiany AD specyficzne dla choroby (Rysunek S2C). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdzają zmniejszoną liczebność modułów bogatych w neurony, którą zaobserwowaliśmy wcześniej w AD (13, 17). Podsumowując, odkryta przez nas analiza sieci proteomu mózgu pozwoliła uzyskać moduły zmienione specyficznie dla AD, co jest zgodne z naszymi wcześniejszymi ustaleniami.
AD charakteryzuje się wczesną fazą bezobjawową (AsymAD), w której u poszczególnych osób obserwuje się akumulację amyloidu bez klinicznego pogorszenia funkcji poznawczych (5, 31). Ten etap bezobjawowy stanowi krytyczny moment na wczesne wykrycie i interwencję. Wcześniej wykazaliśmy silną modułową konserwację proteomu sieci mózgowej AsymAD i AD w niezależnych zestawach danych (13, 17). Aby upewnić się, że obecnie odkryta sieć mózgowa jest zgodna z wcześniejszymi ustaleniami, przeanalizowaliśmy zachowanie 44 modułów w zreplikowanym zestawie danych z 27 organizacji DLPFC. Organizacje te obejmują przypadki kontrolne (n = 10), AsymAD (n = 8) i AD (n = 9). Próbki kontrolne i AD włączono do analizy naszej kohorty mózgów odkrywczych (Tabela S1B), podczas gdy przypadki AsymAD były wyjątkowe tylko w kohorcie replikacyjnej. Przypadki AsymAD również pochodziły z banku mózgów Emory Goizueta ADRC. Chociaż w chwili śmierci funkcje poznawcze były prawidłowe, poziomy amyloidu były nienormalnie wysokie (średnia CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tabela S1B).
Analiza TMT-MS tych 27 tkanek mózgowych umożliwiła ocenę ilościową 11 244 proteomów. Ostateczne zliczenie obejmuje tylko te białka, które stwierdzono ilościowo w co najmniej 50% próbek. Ten zreplikowany zestaw danych zawiera 8638 (98,0%) z 8817 białek wykrytych w naszej analizie mózgu i prawie 3000 znacząco zmienionych białek pomiędzy kohortami kontrolnymi i AD (P <0,05, na podstawie testu t dla par Tukeya do analizy wariancji) ( Tabela S2F). Spośród tych białek o różnej ekspresji 910 wykazywało również istotne zmiany poziomu między AD a przypadkami kontrolnymi proteomu mózgu (P <0,05, po teście t dla par ANOVA Tukeya). Warto zauważyć, że te 910 markerów jest wysoce spójne pod względem kierunku zmian między proteomami (r = 0, 94, P <1, 0 × 10-200) (rysunek S3A). Wśród zwiększonych białek białka o najbardziej spójnych zmianach między zestawami danych to głównie członkowie bogatych w glej modułów M5 i M18 (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 i GFAP). Wśród białek zredukowanych te z najbardziej spójnymi zmianami były prawie wyłącznie członkami modułu M1 (NPTX2, VGF i RPH3A) związanego z synapsą. Następnie zweryfikowaliśmy związane z AD zmiany midkiny (MDK), CD44, wydzielanego białka 1 związanego z frizzled (SFRP1) i VGF za pomocą Western blot (Figura S3B). Analiza zachowania modułów wykazała, że ​​około 80% modułów białkowych (34/44) w proteomie mózgu było znacząco konserwatywnych w zestawie danych replikacji (wynik z> 1, 96, P <0, 05 skorygowane przez FDR) (rysunek S3C). Czternaście z tych modułów zostało specjalnie zarezerwowanych między dwoma proteomami (wynik z> 10, P <1, 0 × 10-23 skorygowane przez FDR). Ogólnie rzecz biorąc, odkrycie i replikacja wysokiego stopnia spójności zróżnicowanej ekspresji i składu modułowego pomiędzy proteomami mózgu podkreśla powtarzalność zmian w białkach kory czołowej AD. Ponadto potwierdziło również, że AsymAD i bardziej zaawansowane choroby mają bardzo podobną strukturę sieci mózgowej.
Bardziej szczegółowa analiza zróżnicowanej ekspresji w zestawie danych dotyczących replikacji mózgu podkreśla znaczny stopień zmian w białku AsymAD, w tym łącznie 151 znacząco zmienionych białek między AsymAD a kontrolą (P <0, 05) (Rysunek S3D). Odpowiednio do obciążenia amyloidem, APP w mózgu AsymAD i AD znacząco wzrasta. MAPT zmienia się znacząco jedynie w AD, co jest zgodne ze zwiększonym poziomem splątków i jego znaną korelacją z pogorszeniem funkcji poznawczych (5, 7). Moduły bogate w glej (M5 i M18) są silnie odzwierciedlone w podwyższonych białkach w AsymAD, podczas gdy moduł M1 związany z neuronami jest najbardziej reprezentatywny dla zmniejszonych białek w AsymAD. Wiele z tych markerów AsymAD wykazuje większe zmiany w chorobach objawowych. Wśród tych markerów znajduje się SMOC1, białko glejowe należące do M18, które jest powiązane z nowotworami mózgu oraz rozwojem oczu i kończyn (32). MDK to czynnik wzrostu wiążący heparynę związany ze wzrostem komórek i angiogenezą (33), kolejny członek M18. W porównaniu z grupą kontrolną, AsymAD znacznie wzrósł, po czym nastąpił większy wzrost AD. Natomiast w mózgu AsymAD stwierdzono znaczne zmniejszenie poziomu białka synaptycznego neuropentraksyny 2 (NPTX2). NPTX2 łączono wcześniej z neurodegeneracją i odgrywa uznaną rolę w pośredniczeniu w synapsach pobudzających (34). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te ujawniają szereg różnych przedklinicznych zmian w białkach w AD, które wydają się postępować wraz z ciężkością choroby.
Biorąc pod uwagę, że osiągnęliśmy znaczną głębokość pokrycia białkami podczas odkrycia proteomu mózgu, staramy się pełniej zrozumieć jego nakładanie się na transkryptom AD na poziomie sieci. Dlatego porównaliśmy odkryty proteom mózgu z modułem, który wcześniej wygenerowaliśmy na podstawie pomiaru mikromacierzy 18 204 genów w tkankach AD (n = 308) i kontrolnych (n = 157) DLPFC (13). nakładające się. W sumie zidentyfikowaliśmy 20 różnych modułów RNA, z których wiele wykazało wzbogacenie określonych typów komórek, w tym neuronów, oligodendrocytów, astrocytów i mikrogleju (ryc. 3A). Wielokrotne zmiany tych modułów w AD pokazano na rysunku 3B. Zgodnie z naszą poprzednią analizą nakładania się białek i RNA przy użyciu głębszego, nieznakowanego proteomu MS (około 3000 białek) (13), większość z 44 modułów w sieci proteomów mózgu, które znaleźliśmy, znajduje się w sieci transkryptomów. Nie ma znaczącego nakładania się. Nawet w nasze odkrycie i replikacja 34 modułów białkowych, które są w dużym stopniu zachowane w proteomie mózgu, tylko 14 (~40%) przeszło dokładny test Fishera (FET), okazało się, że statystycznie istotne pokrywają się z transkryptomem (Rysunek 3A). Kompatybilny z naprawą uszkodzeń DNA (P-M25 i P-M19), translacją białek (P-M7 i P-M20), wiązaniem/składaniem RNA (P-M16 i P-M21) i celowaniem w białka (P-M13 i P- M23) nie pokrywa się z modułami w transkryptomie. Dlatego też, chociaż w bieżącej analizie nakładania się wykorzystuje się głębszy zestaw danych proteomu (13), większość proteomu sieci AD nie jest mapowana na sieć transkryptomu.
(A) Hipergeometryczny FET pokazuje wzbogacenie markerów specyficznych dla typu komórki w module RNA transkryptomu AD (na górze) oraz stopień nakładania się modułów RNA (oś x) i białek (oś y) mózgu AD (spód) . Intensywność cieniowania czerwonego wskazuje stopień wzbogacenia typów komórek w górnym panelu i intensywność nakładania się modułów w dolnym panelu. Gwiazdki wskazują istotność statystyczną (P <0,05). (B) Stopień korelacji między charakterystycznymi genami każdego modułu transkryptomu a stanem AD. Moduły po lewej stronie są najbardziej ujemnie skorelowane z AD (niebieski), a te po prawej stronie są najbardziej dodatnio skorelowane z AD (czerwony). Wartość P skorygowana o BH przekształcona logarytmicznie wskazuje stopień istotności statystycznej każdej korelacji. (C) Znaczące nakładające się moduły ze wspólnym wzbogacaniem typów komórek. (D) Analiza korelacji log2-krotnej zmiany znakowanego białka (oś x) i RNA (oś y) w nakładającym się module. Wyświetlany jest współczynnik korelacji Pearsona z odpowiednią wartością P. Mikro, mikroglej; ciała niebieskie, astrocyty. Tomografia komputerowa, kontrola.
Większość nakładających się modułów białek i RNA ma podobne profile wzbogacenia typu komórek i spójne kierunki zmian AD (Rysunek 3, B i C). Innymi słowy, związany z synapsą moduł M1 proteomu mózgu (PM​1) jest mapowany na trzy bogate w neurony homologiczne moduły RNA (R-M1, R-M9 i R-M16), które są w AD. Obydwa wykazały obniżony poziom. Podobnie moduły białkowe M5 i M18 bogate w glej pokrywają się z modułami RNA bogatymi w astrocyty i markery mikrogleju (R-M3, R-M7 i R-M10) i są silnie zaangażowane w rozwój chorób. Te wspólne cechy modułowe obu zestawów danych dodatkowo wspierają wzbogacanie typów komórek i zmiany związane z chorobami, które zaobserwowaliśmy w proteomie mózgu. Zaobserwowaliśmy jednak wiele znaczących różnic między poziomami RNA i białek poszczególnych markerów w tych wspólnych modułach. Analiza korelacji zróżnicowanej ekspresji proteomiki i transkryptomiki cząsteczek w obrębie tych nakładających się modułów (rysunek 3D) podkreśla tę niespójność. Na przykład APP i kilka innych białek modułu glejowego (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 i SFRP1) wykazały znaczny wzrost proteomu AD, ale prawie nie było zmian w transkryptomie AD. Te zmiany specyficzne dla białka mogą być ściśle powiązane z płytkami amyloidowymi (23, 35), co podkreśla proteom jako źródło zmian patologicznych, a zmiany te mogą nie być odzwierciedlone w transkryptomie.
Po niezależnej analizie odkrytych przez nas proteomów mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego przeprowadziliśmy wszechstronną analizę dwóch zestawów danych, aby zidentyfikować biomarkery CSF AD związane z patofizjologią sieci mózgowej. Musimy najpierw zdefiniować nakładanie się dwóch proteomów. Chociaż powszechnie przyjmuje się, że płyn mózgowo-rdzeniowy odzwierciedla zmiany neurochemiczne w mózgu AD (4), dokładny stopień nakładania się mózgu AD i proteomu płynu mózgowo-rdzeniowego jest niejasny. Porównując liczbę wspólnych produktów genowych wykrytych w naszych dwóch proteomach, odkryliśmy, że prawie 70% (n = 1936) białek zidentyfikowanych w płynie mózgowo-rdzeniowym oznaczono również ilościowo w mózgu (ryc. 4A). Większość z tych nakładających się białek (n = 1721) jest mapowana na jeden z 44 modułów koekspresji ze zbioru danych mózgu odkrywającego (Rysunek 4B). Zgodnie z oczekiwaniami, sześć największych modułów mózgu (M1 do M6) wykazywało największe nakładanie się płynu mózgowo-rdzeniowego. Istnieją jednak mniejsze moduły mózgu (na przykład M15 i M29), które osiągają nieoczekiwanie wysoki stopień nakładania się, większy niż moduł mózgu dwukrotnie większy. Motywuje nas to do przyjęcia bardziej szczegółowej, opartej na statystyce metody obliczania nakładania się mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego.
(A i B) Białka wykryte w zbiorach danych dotyczących mózgu odkrywczego i płynu mózgowo-rdzeniowego nakładają się. Większość z tych nakładających się białek jest powiązana z jednym z 44 modułów koekspresji sieci koekspresji w mózgu. (C) Odkryj nakładanie się proteomu płynu mózgowo-rdzeniowego i proteomu sieci mózgowej. Każdy wiersz mapy cieplnej reprezentuje oddzielną analizę nakładania się hipergeometrycznego FET. Górny rząd przedstawia nakładanie się (szare/czarne cieniowanie) modułu mózgu i całego proteomu CSF. Druga linia przedstawia, że ​​nakładanie się modułów mózgu i białka CSF (zacieniowanego na czerwono) jest znacząco zwiększone w przypadku AD (P <0,05). Trzeci rząd pokazuje, że nakładanie się modułów mózgu i białka CSF (niebieskie zabarwienie) jest znacząco obniżone w AD (P <0,05). Użyj metody BH, aby skorygować wartość P uzyskaną z FET. (D) Składany panel modułu oparty na powiązaniu typu komórki i powiązanych terminach GO. Panele te zawierają łącznie 271 białek związanych z mózgiem, które wykazują znaczącą zróżnicowaną ekspresję w proteomie CSF.
Korzystając z jednostronnych FET, oceniliśmy znaczenie nakładania się białek między proteomem CSF i poszczególnymi modułami mózgu. Analiza wykazała, że ​​łącznie 14 modułów mózgu w zbiorze danych CSF ma statystycznie istotne nakładanie się (P <0,05 skorygowane FDR), a dodatkowy moduł (M18), którego nakładanie się jest bliskie istotności (P = 0,06 skorygowane FDR) (Rysunek 4C , górny rząd). Interesują nas także moduły, które silnie pokrywają się z białkami CSF o różnej ekspresji. Dlatego zastosowaliśmy dwie dodatkowe analizy FET, aby określić, które z (i) białka CSF było znacząco zwiększone w AD i (ii) białko CSF ​​było znacząco obniżone w AD (P <0,05, test t dla par AD/kontrola) Moduły mózgu ze znaczącym nakładaniem się między nimi. Jak pokazano w środkowym i dolnym rzędzie ryciny 4C, te dodatkowe analizy pokazują, że 8 z 44 modułów mózgowych w znacznym stopniu pokrywa się z białkiem dodanym w płynie mózgowo-rdzeniowym AD (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 i M38). . ), podczas gdy tylko dwa moduły (M6 i M15) wykazały znaczące nakładanie się na zmniejszone białko w CSF AD. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie 10 modułów znajduje się w 15 modułach o największym nakładaniu się z proteomem CSF. Dlatego zakładamy, że te 15 modułów jest wysokowydajnymi źródłami biomarkerów CSF pochodzących z mózgu AD.
Złożyliśmy te 15 nakładających się modułów na pięć dużych paneli białkowych w oparciu o ich bliskość na diagramie drzewa WGCNA i ich powiązanie z typami komórek i ontologią genów (Rysunek 4D). Pierwszy panel zawiera moduły bogate w markery neuronowe i białka związane z synapsami (M1 i M12). Panel synaptyczny zawiera łącznie 94 białka, a poziomy w proteomie CSF znacząco się zmieniły, co czyni go największym źródłem markerów CSF związanych z mózgiem spośród pięciu paneli. Druga grupa (M6 i M15) wykazała ścisły związek z markerami komórek śródbłonka i ciałem naczyniowym, takimi jak „gojenie się ran” (M6) i „regulacja humoralnej odpowiedzi immunologicznej” (M15). M15 jest również silnie powiązany z metabolizmem lipoprotein, który jest ściśle powiązany ze śródbłonkiem (36). Panel naczyniowy zawiera 34 markery płynu mózgowo-rdzeniowego związane z mózgiem. Trzecia grupa obejmuje moduły (M2 i M4), które są istotnie powiązane z markerami oligodendrocytów i proliferacją komórek. Na przykład terminy ontologiczne najwyższego poziomu M2 obejmują „pozytywną regulację replikacji DNA” i „proces biosyntezy puryn”. Tymczasem te dotyczące M4 obejmują „różnicowanie komórek glejowych” i „segregację chromosomów”. Panel mielinizacji zawiera 49 markerów CSF związanych z mózgiem.
Czwarta grupa zawiera najwięcej modułów (M30, M29, M18, M24 i M5), a prawie wszystkie moduły są znacznie bogate w markery mikrogleju i astrocytów. Podobnie jak panel mielinizacji, czwarty panel zawiera również moduły (M30, M29 i M18), które są ściśle związane z proliferacją komórek. Pozostałe moduły w tej grupie są silnie powiązane z terminami immunologicznymi, takimi jak „proces efektu immunologicznego” (M5) i „regulacja odpowiedzi immunologicznej” (M24). Grupa odpornościowa glejów zawiera 42 markery płynu mózgowo-rdzeniowego związane z mózgiem. Wreszcie ostatni panel zawiera 52 markery związane z mózgiem w czterech modułach (M44, M3, M33 i M38), z których wszystkie znajdują się w organizmie i są związane z magazynowaniem energii i metabolizmem. Największy z tych modułów (M3) jest blisko spokrewniony z mitochondriami i jest bogaty w markery specyficzne dla neuronów. M38 jest jednym z mniejszych członków modułu w tym metabolomie i również wykazuje umiarkowaną specyficzność neuronową.
Ogólnie rzecz biorąc, te pięć paneli odzwierciedla szeroki zakres typów komórek i funkcji w korze AD i łącznie zawiera 271 markerów CSF związanych z mózgiem (Tabela S2G). Aby ocenić wiarygodność wyników stwardnienia rozsianego, zastosowaliśmy test rozszerzenia bliskości (PEA), technologię opartą na przeciwciałach ortogonalnych, charakteryzującą się możliwością multipleksowania, wysoką czułością i swoistością, a także ponownie przeanalizowaliśmy znalezione próbki płynu mózgowo-rdzeniowego. Podzbiór tych 271 biomarkerów (n = 36). Te 36 celów pokazuje zmianę wielokrotności AD PEA, która jest ściśle powiązana z naszymi ustaleniami opartymi na stwardnieniu rozsianym (r = 0, 87, P = 5, 6 × 10-12), co silnie zweryfikowało wyniki naszej kompleksowej analizy stwardnienia rozsianego (rysunek S4 ).
Wszystkie tematy biologiczne podkreślane przez pięć naszych grup, od sygnalizacji synaptycznej po metabolizm energetyczny, są powiązane z patogenezą AD (1-3). Dlatego wszystkie 15 modułów zawierających te panele jest powiązanych z odkrytą przez nas patologią AD w proteomie mózgu (Rysunek 2B). Najbardziej zauważalna jest wysoka dodatnia korelacja patologiczna między naszymi modułami glejowymi i silna ujemna korelacja patologiczna między naszymi największymi modułami neuronalnymi (M1 i M3). Analiza różnicowej ekspresji naszego replikowanego proteomu mózgu (rysunek S3D) również podkreśla białka glejowe pochodzące z M5 i M18. W AsymAD i objawowej AD najbardziej wzrasta ilość białek glejowych i synaps związanych z M1. Białko jest najbardziej zmniejszone. Obserwacje te wskazują, że 271 markerów płynu mózgowo-rdzeniowego, które zidentyfikowaliśmy w pięciu grupach, jest związanych z procesami chorobowymi w korze AD, w tym tymi, które występują we wczesnych stadiach bezobjawowych.
Aby lepiej przeanalizować kierunek zmian białek panelowych w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym, dla każdego z 15 nakładających się modułów narysowaliśmy co następuje: (i) ustaliliśmy poziom obfitości modułów w zbiorze danych mózgowych oraz (ii) moduł białko Różnica jest wyrażona w płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. S5). Jak wspomniano wcześniej, WGCNA służy do określenia liczebności modułu lub charakterystycznej wartości białka w mózgu (13). Mapę wulkanu stosuje się do opisu zróżnicowanej ekspresji białek modułowych w płynie mózgowo-rdzeniowym (AD/kontrola). Liczby te pokazują, że trzy z pięciu paneli pokazują różne trendy ekspresji w płynie mózgowym i rdzeniowym. Dwa moduły panelu synaps (M1 i M12) wykazują spadek poziomu liczebności w mózgu AD, ale znacząco nakładają się na zwiększone białko w płynie mózgowo-rdzeniowym AD (Rysunek S5A). Moduły związane z neuronami zawierające metabolom (M3 i M38) wykazywały podobne, niespójne wzorce ekspresji w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym (Rysunek S5E). Panel naczyniowy również wykazywał różne trendy ekspresji, chociaż jego moduły (M6 i M15) były umiarkowanie zwiększone w mózgu AD i obniżone w chorym CSF (ryc. S5B). Pozostałe dwa panele zawierają duże sieci glejowe, których białka są stale zwiększone w obu przedziałach (Rysunek S5, C i D).
Należy pamiętać, że te trendy nie są wspólne dla wszystkich znaczników w tych panelach. Na przykład panel synaptyczny zawiera kilka białek, których ilość jest znacznie zmniejszona w mózgu AD i płynie mózgowo-rdzeniowym (Rysunek S5A). Do tych obniżonych markerów płynu mózgowo-rdzeniowego należą NPTX2 i VGF M1 oraz chromogranina B M12. Jednakże pomimo tych wyjątków większość naszych markerów synaptycznych jest podwyższona w płynie mózgowo-rdzeniowym związanym z chorobą Alzheimera. Ogólnie rzecz biorąc, analizy te pozwoliły rozróżnić statystycznie istotne trendy w poziomach płynu mózgowo-rdzeniowego w każdym z pięciu paneli. Tendencje te podkreślają złożony i często odmienny związek między ekspresją białek w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym w chorobie Alzheimera.
Następnie zastosowaliśmy wysokoprzepustową analizę replikacji MS (replikacja CSF 1), aby zawęzić nasz zestaw 271 biomarkerów do najbardziej obiecujących i powtarzalnych celów (ryc. 5A). Kopia 1 CSF zawiera łącznie 96 próbek od Emory Goizueta ADRC, w tym kohortę kontrolną, AsymAD i AD (Tabela S1A). Te przypadki AD charakteryzują się łagodnym pogorszeniem funkcji poznawczych (średnia MoCA, 20,0 ± 3,8) i zmianami w biomarkerach AD potwierdzonymi w płynie mózgowo-rdzeniowym (Tabela S1A). W przeciwieństwie do analizy CSF, którą odkryliśmy, replikacja ta jest wykonywana przy użyciu bardziej wydajnej i wysokowydajnej metody MS „single-shot” (bez frakcjonowania poza linią), w tym uproszczonego protokołu przygotowania próbki, który eliminuje potrzebę utraty odporności poszczególnych próbek . Zamiast tego wykorzystuje się pojedynczy „kanał wzmocnienia” o obniżonej odporności do wzmacniania sygnału białek występujących w mniejszej ilości (37). Chociaż zmniejsza to całkowite pokrycie proteomem, ta jednorazowa metoda znacznie skraca czas pracy maszyny i zwiększa liczbę próbek znakowanych TMT, które można żywotnie analizować (17, 38). W sumie analiza zidentyfikowała 6487 peptydów, które w 96 przypadkach zmapowano do 1183 proteomów. Podobnie jak w przypadku analizy płynu mózgowo-rdzeniowego, którą odkryliśmy, w kolejnych obliczeniach uwzględniono tylko białka określone ilościowo w co najmniej 50% próbek, a dane poddano regresji pod kątem wpływu wieku i płci. Doprowadziło to do ostatecznej oceny ilościowej 792 proteomów, z których 95% zidentyfikowano również w znalezionym zestawie danych CSF.
(A) Docelowe białka CSF związane z mózgiem zweryfikowane w pierwszej replikowanej kohorcie CSF i uwzględnione w końcowym panelu (n = 60). (B do E) Panelowe poziomy biomarkerów (złożone wyniki Z) mierzone w czterech kohortach replikacji płynu mózgowo-rdzeniowego. Do oceny istotności statystycznej zmian w liczebności w każdej analizie powtórzeń wykorzystano sparowane testy t lub ANOVA z poprawką końcową Tukeya. Tomografia komputerowa, kontrola.
Ponieważ jesteśmy szczególnie zainteresowani weryfikacją naszych 271 celów CSF związanych z mózgiem poprzez wszechstronną analizę, ograniczymy dalsze badanie tego replikowanego proteomu do tych markerów. Spośród tych 271 białek 100 wykryto w replikacji CSF 1. Figura S6A przedstawia zróżnicowaną ekspresję tych 100 nakładających się markerów pomiędzy próbkami kontrolnymi i próbkami replikacji AD. Histony synaptyczne i metabolity zwiększają się najbardziej w AD, podczas gdy białka naczyniowe najbardziej zmniejszają się w chorobie. Większość ze 100 nakładających się markerów (n = 70) utrzymała ten sam kierunek zmian w dwóch zestawach danych (rysunek S6B). Te 70 zatwierdzonych markerów CSF związanych z mózgiem (Tabela S2H) w dużej mierze odzwierciedlają wcześniej obserwowane trendy ekspresji panelu, to znaczy regulację w dół białek naczyniowych i regulację w górę wszystkich innych paneli. Tylko 10 z tych 70 zatwierdzonych białek wykazywało zmiany w liczebności AD, które były sprzeczne z trendami panelowymi. Aby wygenerować panel, który najlepiej odzwierciedla ogólny trend w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym, wykluczyliśmy te 10 białek z panelu będącego przedmiotem zainteresowania, który ostatecznie zweryfikowaliśmy (Rysunek 5A). Dlatego nasz panel ostatecznie obejmuje łącznie 60 białek zweryfikowanych w dwóch niezależnych kohortach AD w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu innego przygotowania próbek i analizy platformy MS. Wykresy ekspresji wyniku z tych końcowych paneli w kopii kontrolnej CSF 1 i przypadkach AD potwierdziły trend panelowy obserwowany w znalezionej przez nas kohorcie CSF (Rysunek 5B).
Wśród tych 60 białek znajdują się cząsteczki powiązane z chorobą Alzheimera, takie jak osteopontyna (SPP1), która jest cytokiną prozapalną, która w wielu badaniach została powiązana z chorobą Alzheimera (39-41), oraz GAP43, białko synaptyczne co jest wyraźnie powiązane z neurodegeneracją (42). Najpełniej zweryfikowanymi białkami są markery związane z innymi chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) związane z dysmutazą ponadtlenkową 1 (SOD1) i desacharaza związana z chorobą Parkinsona (PARK7). Sprawdziliśmy również, że wiele innych markerów, takich jak SMOC1 i białko sygnalizujące przyłączenie do błony bogate w mózg 1 (BASP1), miało ograniczone wcześniejsze powiązania z neurodegeneracją. Warto zauważyć, że ze względu na ich niską ogólną liczebność w proteomie płynu mózgowo-rdzeniowego trudno jest nam zastosować tę wysokowydajną metodę wykrywania pojedynczego impulsu do niezawodnego wykrywania MAPT i niektórych innych białek związanych z AD (na przykład NEFL i NRGN ) ( 43, 44).
Następnie sprawdziliśmy te 60 markerów panelu priorytetowego w trzech dodatkowych analizach powtórzeń. W CSF Copy 2 użyliśmy pojedynczego TMT-MS do analizy niezależnej kohorty 297 próbek kontrolnych i próbek AD od Emory Goizueta ADRC (17). Replikacja płynu mózgowo-rdzeniowego 3 obejmowała ponowną analizę dostępnych danych TMT-MS od 120 pacjentów z grupy kontrolnej i pacjentów z AD z Lozanny w Szwajcarii (45). Wykryliśmy ponad dwie trzecie z 60 markerów priorytetowych w każdym zbiorze danych. Chociaż w szwajcarskim badaniu wykorzystano różne platformy MS i metody kwantyfikacji TMT (45, 46), w dwóch powtarzanych analizach silnie odtworzyliśmy trendy panelowe (ryc. 5, C i D oraz tabele S2, I i J). Aby ocenić specyficzność choroby w naszej grupie, wykorzystaliśmy TMT-MS do analizy czwartego zestawu danych replikacji (replikacja CSF 4), który obejmował nie tylko przypadki kontrolne (n = 18) i AD (n = 17), ale także przypadki PD ( n = 14)), ALS (n = 18) i próbki otępienia czołowo-skroniowego (FTD) (n = 11) (Tabela S1A). Udało nam się określić ilościowo prawie dwie trzecie białek panelowych w tej kohorcie (38 z 60). Wyniki te podkreślają zmiany specyficzne dla AD we wszystkich pięciu panelach biomarkerów (ryc. 5E i tabela S2K). Wzrost w grupie metabolitów wykazał najsilniejszą specyficzność wobec AD, a następnie w grupie mielinizacji i glejów. W mniejszym stopniu FTD wykazuje również wzrost między tymi panelami, co może odzwierciedlać podobne potencjalne zmiany w sieci (17). Natomiast ALS i PD wykazały prawie takie same profile mielinizacji, glejów i metabolomu jak grupa kontrolna. Ogólnie rzecz biorąc, pomimo różnic w przygotowaniu próbki, platformie MS i metodach ilościowych TMT, te powtarzane analizy pokazują, że nasze markery panelu priorytetowego wykazują wysoce spójne zmiany specyficzne dla AD w ponad 500 unikalnych próbkach CSF.
Neurodegenerację AD powszechnie rozpoznano na kilka lat przed wystąpieniem objawów poznawczych, dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania biomarkerów AsymAD (5, 31). Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że biologia AsymAD jest daleka od jednorodności, a złożona interakcja ryzyka i odporności prowadzi do dużych różnic indywidualnych w późniejszym postępie choroby (47). Chociaż poziomy kluczowych biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego (Aβ1-42, całkowitego tau i p-tau) wykorzystywane do identyfikacji przypadków AsymAD, nie okazały się być w stanie wiarygodnie przewidzieć, kto przejdzie do demencji (4, 7), co wskazuje, że może to być konieczne jest uwzględnienie holistycznych narzędzi biomarkerów opartych na wielu aspektach fizjologii mózgu, aby dokładnie określić ryzyko w tej populacji. Dlatego następnie przeanalizowaliśmy nasz panel biomarkerów zatwierdzony przez AD w populacji AsymAD kopii 1 płynu mózgowo-rdzeniowego. Te 31 przypadków AsymAD wykazało nieprawidłowe poziomy podstawowych biomarkerów (stosunek Aβ1–42/całkowite tau ELISA <5,5) i pełne funkcje poznawcze (średnia MoCA, 27,1 ± 2,2) (Tabela S1A). Ponadto u wszystkich osób z AsymAD kliniczny wynik w zakresie demencji wynosi 0, co wskazuje, że nie ma dowodów na spadek codziennych funkcji poznawczych lub funkcjonalnych.
Najpierw przeanalizowaliśmy poziomy zwalidowanych paneli we wszystkich 96 powtórzeniach CSF 1, w tym w kohorcie AsymAD. Odkryliśmy, że kilka paneli w grupie AsymAD wykazywało znaczące zmiany liczebności podobne do AD, panel naczyniowy wykazywał tendencję spadkową w AsymAD, podczas gdy wszystkie inne panele wykazywały tendencję wzrostową (ryc. 6A). Dlatego wszystkie panele wykazały wysoce istotną korelację z poziomami Aβ1-42 w teście ELISA i całkowitym tau (Figura 6B). Natomiast korelacja między grupą a wynikiem MoCA jest stosunkowo słaba. Jednym z bardziej uderzających wniosków z tych analiz jest duży zakres liczebności paneli w kohorcie AsymAD. Jak pokazano na rysunku 6A, poziom panelu grupy AsymAD zwykle krzyżuje się z poziomem panelu grupy kontrolnej i grupy AD, wykazując stosunkowo dużą zmienność. Aby dokładniej zbadać tę heterogeniczność AsymAD, zastosowaliśmy analizę skalowania wielowymiarowego (MDS) do 96 przypadków replikacji CSF 1. Analiza MDS pozwala na wizualizację podobieństwa pomiędzy przypadkami na podstawie określonych zmiennych w zbiorze danych. Do tej analizy skupień używamy tylko tych zwalidowanych markerów panelowych, które mają statystycznie istotną zmianę (P <0,05, AD/kontrola) w poziomie proteomu 1 wykrywania i replikacji CSF (n = 29) (Tabela S2L). Analiza ta dała wyraźne skupienie przestrzenne pomiędzy naszymi przypadkami kontrolnymi i AD (Rysunek 6C). Dla kontrastu, niektóre przypadki AsymAD są wyraźnie skupione w grupie kontrolnej, podczas gdy inne są umiejscowione w przypadkach AD. Aby dokładniej zbadać tę heterogeniczność AsymAD, wykorzystaliśmy naszą mapę MDS do zdefiniowania dwóch grup tych przypadków AsymAD. Do pierwszej grupy zaliczały się przypadki AsymAD skupione bliżej kontroli (n = 19), natomiast drugą grupę charakteryzowały przypadki AsymAD z profilem markerów bliższym AD (n = 12).
(A) Poziom ekspresji (wynik z) grupy biomarkerów CSF we wszystkich 96 próbkach w kohorcie 1 replikacji CSF, w tym AsymAD. Do oceny istotności statystycznej zmian liczebności panelu wykorzystano analizę wariancji z poprawką końcową Tukeya. (B) Analiza korelacji poziomu obfitości białka panelowego (wynik z) z wynikiem MoCA i całkowitym poziomem tau w próbkach ELISA Aβ1-42 i kopii 1 CSF. Wyświetlany jest współczynnik korelacji Pearsona z odpowiednią wartością P. (C) MDS 96 przypadków kopii 1 CSF oparto na poziomach liczebności 29 zatwierdzonych markerów panelowych, które uległy istotnym zmianom zarówno w zestawie danych dotyczących odkrycia, jak i kopii 1 CSF [P <0,05 AD/kontrola (CT)]. Analizę tę wykorzystano do podziału grupy AsymAD na podgrupę kontrolną (n = 19) i AD (n = 12). (D) Wykres wulkanu pokazuje zróżnicowaną ekspresję wszystkich białek replikacji 1 CSF z log2-krotną zmianą (oś x) w stosunku do statystycznej wartości P -log10 pomiędzy dwiema podgrupami AsymAD. Biomarkery panelu są kolorowe. (E) Poziom liczebności replikacji CSF 1 biomarkerów grupy selekcyjnej ulega zróżnicowanej ekspresji pomiędzy podgrupami AsymAD. Do oceny istotności statystycznej wykorzystano później skorygowaną analizę wariancji Tukeya.
Zbadaliśmy zróżnicowaną ekspresję białka między tymi kontrolnymi i podobnymi do AD przypadkami AsymAD (ryc. 6D i tabela S2L). Powstała mapa wulkanu pokazuje, że 14 znaczników panelowych zmieniło się znacząco między obiema grupami. Większość z tych markerów należy do synapsy i metabolomu. Jednakże SOD1 i mirystoilowany substrat kinazy białkowej C bogatej w alaninę (MARCKS), które należą odpowiednio do grup odpornościowych mieliny i glejów, również należą do tej grupy (Figura 6, D i E). Panel naczyniowy dostarczył również dwóch markerów, które były znacznie zmniejszone w grupie AsymAD podobnej do AD, w tym białko wiążące AE 1 (AEBP1) i członek rodziny dopełniacza C9. Nie było istotnej różnicy pomiędzy podgrupą kontrolną a podgrupą AsymAD podobną do AD w teście ELISA AB1-42 (P = 0,38) i p-tau (P = 0,28), ale rzeczywiście istniała istotna różnica w całkowitym poziomie tau (P = 0,0031 ) (Rys. S7). Istnieje kilka markerów panelowych, które wskazują, że zmiany między dwiema podgrupami AsymAD są bardziej znaczące niż całkowite poziomy tau (na przykład YWHAZ, SOD1 i MDH1) (Rysunek 6E). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują, że nasz zatwierdzony panel może zawierać biomarkery umożliwiające podtyp i potencjalną stratyfikację ryzyka pacjentów z chorobą bezobjawową.
Istnieje pilna potrzeba opracowania systemowych narzędzi biomarkerów, które umożliwiłyby lepszy pomiar i ukierunkowanie różnych patofizjologii stojących za chorobą Alzheimera. Oczekuje się, że narzędzia te nie tylko zmienią nasze ramy diagnostyczne AD, ale także będą promować przyjęcie skutecznych, dostosowanych do potrzeb pacjenta strategii leczenia (1, 2). W tym celu zastosowaliśmy bezstronne, kompleksowe podejście proteomiczne do mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego w przypadku choroby Alzheimera, aby zidentyfikować internetowe biomarkery płynu mózgowo-rdzeniowego, które odzwierciedlają szeroki zakres patofizjologii mózgu. W wyniku naszej analizy uzyskano pięć paneli biomarkerów płynu mózgowo-rdzeniowego, które (i) odzwierciedlają synapsy, naczynia krwionośne, mielinę, dysfunkcję immunologiczną i metaboliczną; (ii) wykazać dużą odtwarzalność na różnych platformach państw członkowskich; (iii) Wykazują postępujące zmiany specyficzne dla choroby we wczesnych i późnych stadiach choroby Alzheimera. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia te stanowią obiecujący krok w kierunku opracowania różnorodnych, niezawodnych, internetowych narzędzi biomarkerowych do badań nad chorobą Alzheimera i zastosowań klinicznych.
Nasze wyniki pokazują wysoce konserwatywną organizację proteomu sieci mózgu AD i potwierdzają jego zastosowanie jako kotwicy w rozwoju biomarkerów opartych na systemie. Nasza analiza pokazuje, że dwa niezależne zbiory danych TMT-MS zawierające mózgi AD i AsymAD mają silną modułowość. Odkrycia te stanowią kontynuację naszej poprzedniej pracy, wykazując zachowanie potężnych modułów ponad 2000 tkanek mózgowych z wielu niezależnych kohort w korze czołowej, ciemieniowej i skroniowej (17). Ta sieć konsensusu odzwierciedla różne zmiany związane z chorobami obserwowane w bieżących badaniach, w tym wzrost modułów zapalnych bogatych w glej i zmniejszenie modułów bogatych w neurony. Podobnie jak obecne badania, ta zakrojona na dużą skalę sieć charakteryzuje się również znaczącymi zmianami modułowymi w AsymAD, wykazując różnorodność różnych patofizjologii przedklinicznej (17).
Jednakże w ramach tych wysoce konserwatywnych ram systemowych występuje bardziej drobnoziarnista heterogeniczność biologiczna, szczególnie wśród osób we wczesnych stadiach choroby Alzheimera. Nasz panel biomarkerów jest w stanie przedstawić dwie podgrupy w AsymAD, które wykazują znaczącą zróżnicowaną ekspresję wielu markerów CSF. Naszej grupie udało się podkreślić różnice biologiczne między tymi dwiema podgrupami, które nie były oczywiste na poziomie podstawowych biomarkerów AD. W porównaniu z grupą kontrolną, stosunek Aβ1-42 do całkowitego tau u osób z AsymAD był nienormalnie niski. Jednakże tylko całkowite poziomy tau różniły się istotnie pomiędzy dwiema podgrupami AsymAD, podczas gdy poziomy Aβ1-42 i p-tau pozostały stosunkowo porównywalne. Ponieważ wysoki poziom tau w płynie mózgowo-rdzeniowym wydaje się być lepszym prognostykiem objawów poznawczych niż poziom Aβ1-42 (7), podejrzewamy, że obie kohorty AsymAD mogą charakteryzować się różnym ryzykiem postępu choroby. Biorąc pod uwagę ograniczoną wielkość próby naszego AsymAD i brak danych podłużnych, potrzebne są dalsze badania, aby z pewnością wyciągnąć te wnioski. Wyniki te wskazują jednak, że oparty na systemie panel CSF może zwiększyć naszą zdolność do skutecznej stratyfikacji osób w bezobjawowym stadium choroby.
Ogólnie rzecz biorąc, nasze odkrycia potwierdzają rolę wielu funkcji biologicznych w patogenezie AD. Jednak rozregulowany metabolizm energetyczny stał się głównym tematem wszystkich pięciu zatwierdzonych paneli dotyczących etykietowania. Białka metaboliczne, takie jak fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa 1 (HPRT1) i dehydrogenaza mleczanowa A (LDHA), są najlepiej potwierdzonymi biomarkerami synaptycznymi, co wskazuje, że wzrost AD CSF jest wysoce powtarzalny pod względem płci. Nasze naczynia krwionośne i panele glejowe zawierają również kilka markerów biorących udział w metabolizmie substancji utleniających. Odkrycia te są zgodne z kluczową rolą, jaką procesy metaboliczne odgrywają w całym mózgu, nie tylko w celu zaspokojenia wysokiego zapotrzebowania neuronów na energię, ale także w celu zaspokojenia wysokiego zapotrzebowania na energię astrocytów i innych komórek glejowych (17, 48). Nasze wyniki potwierdzają coraz większą liczbę dowodów na to, że zmiany w potencjale redoks i przerwanie szlaków energetycznych mogą być podstawowym ogniwem pomiędzy kilkoma kluczowymi procesami zaangażowanymi w patogenezę choroby Alzheimera, w tym zaburzeniami mitochondrialnymi, zapaleniem glejowym i uszkodzeniem naczyń (49). Ponadto biomarkery metaboliczne płynu mózgowo-rdzeniowego zawierają dużą liczbę białek bogatych w różnice między naszą grupą kontrolną a podgrupą AsymAD podobną do AD, co sugeruje, że zakłócenie tych szlaków energetycznych i redoks może mieć kluczowe znaczenie w przedklinicznym stadium choroby.
Zaobserwowane przez nas różne trendy w panelu mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego mają również interesujące implikacje biologiczne. Synapsy i metabolomy bogate w neurony wykazują obniżony poziom w mózgu chorych na AD i zwiększoną obfitość w płynie mózgowo-rdzeniowym. Biorąc pod uwagę, że neurony są bogate w mitochondria wytwarzające energię w synapsach, które dostarczają energię dla ich licznych wyspecjalizowanych sygnałów (50), oczekuje się podobieństwa profili ekspresji tych dwóch grup neuronów. Utrata neuronów i wytłaczanie uszkodzonych komórek mogą wyjaśniać trendy w panelu mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego w późniejszej chorobie, ale nie mogą wyjaśniać wczesnych zmian w panelu, które obserwujemy (13). Jednym z możliwych wyjaśnień tych zmian we wczesnej fazie bezobjawowej choroby jest nieprawidłowe przycięcie synaptyczne. Nowe dowody uzyskane na modelach mysich sugerują, że fagocytoza synaptyczna za pośrednictwem mikrogleju może być nieprawidłowo aktywowana w chorobie Alzheimera i prowadzić do wczesnej utraty synaps w mózgu (51). Ten odrzucony materiał synaptyczny może gromadzić się w płynie mózgowo-rdzeniowym, dlatego obserwujemy wzrost płynu mózgowo-rdzeniowego w panelu neuronów. Przycinanie synaptyczne za pośrednictwem układu immunologicznego może również częściowo wyjaśniać wzrost białek glejowych, który obserwujemy w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym w trakcie procesu chorobowego. Oprócz przycinania synaptycznego, ogólne nieprawidłowości w szlaku egzocytarnym mogą również prowadzić do różnej ekspresji markerów neuronalnych w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym. Szereg badań wykazało, że zawartość egzosomów w patogenezie mózgu w chorobie Alzheimera uległa zmianie (52). Szlak zewnątrzkomórkowy jest również zaangażowany w proliferację Aβ (53, 54). Warto zauważyć, że supresja wydzielania egzosomalnego może zmniejszyć patologię podobną do AD w modelach myszy transgenicznych AD (55).
W tym samym czasie zawartość białka w panelu naczyniowym wykazywała umiarkowany wzrost w mózgu chorych na AD, ale znacząco spadła w płynie mózgowo-rdzeniowym. Dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) ​​może częściowo wyjaśnić te ustalenia. Wiele niezależnych badań pośmiertnych na ludziach wykazało rozpad BBB w AD (56, 57). Badania te potwierdziły różne nieprawidłowe aktywności otaczające tę szczelnie zamkniętą warstwę komórek śródbłonka, w tym wyciek kapilarny mózgu i okołonaczyniową akumulację białek przenoszonych przez krew (57). Może to stanowić proste wyjaśnienie podwyższonego poziomu białek naczyniowych w mózgu, ale nie może w pełni wyjaśnić wyczerpania się tych samych białek w płynie mózgowo-rdzeniowym. Jedną z możliwości jest to, że centralny układ nerwowy aktywnie izoluje te cząsteczki, aby rozwiązać problem zwiększonego stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego. Redukcja niektórych z najpoważniejszych białek CSF w tym panelu, szczególnie tych zaangażowanych w regulację lipoprotein, jest związana z hamowaniem szkodliwego poziomu stanu zapalnego i procesu neuroprotekcyjnego reaktywnych form tlenu. Dotyczy to paroksonazy 1 (PON1), enzymu wiążącego lipoproteiny odpowiedzialnego za zmniejszenie poziomu stresu oksydacyjnego w krążeniu (58, 59). Prekursor alfa-1-mikroglobuliny/bikuniny (AMBP) to kolejny znacząco obniżony marker grupy naczyniowej. Jest prekursorem bikuniny, transportera lipidów, który bierze również udział w tłumieniu stanu zapalnego i ochronie neurologicznej (60, 61).
Pomimo różnych interesujących hipotez, niemożność bezpośredniego wykrycia biochemicznych mechanizmów chorób jest dobrze znanym ograniczeniem analizy proteomicznej opartej na odkryciach. Dlatego konieczne są dalsze badania, aby z całą pewnością zdefiniować mechanizmy stojące za tymi panelami biomarkerów. Aby pójść w kierunku rozwoju analizy klinicznej opartej na stwardnieniu rozsianym, przyszły kierunek wymaga również zastosowania ukierunkowanych metod ilościowych do weryfikacji biomarkerów na dużą skalę, takich jak selektywne lub równoległe monitorowanie reakcji (62). Niedawno zastosowaliśmy równoległe monitorowanie reakcji (63) w celu sprawdzenia wielu opisanych tutaj zmian w białkach CSF. Kilka priorytetowych celów panelu jest określanych ilościowo ze znaczną dokładnością, w tym YWHAZ, ALDOA i SMOC1, które mapują odpowiednio nasze panele synaps, metabolizmu i stanu zapalnego (63). Niezależne pozyskiwanie danych (DIA) i inne strategie oparte na państwach członkowskich mogą być również przydatne do weryfikacji celów. Bud i in. (64) Niedawno wykazano, że biomarkery AD zidentyfikowane w naszym zestawie danych dotyczących odkrycia CSF w znacznym stopniu pokrywają się z niezależnym zestawem danych DIA-MS, który składa się z prawie 200 próbek płynu mózgowo-rdzeniowego z trzech różnych kohort europejskich. Te ostatnie badania potwierdzają potencjał naszych paneli w zakresie przekształcania się w niezawodną detekcję opartą na stwardnieniu rozsianym. Tradycyjne wykrywanie w oparciu o przeciwciała i aptamery jest również ważne dla dalszego rozwoju kluczowych biomarkerów AD. Ze względu na małą liczebność płynu mózgowo-rdzeniowego trudniej jest wykryć te biomarkery przy użyciu wysokowydajnych metod MS. NEFL i NRGN to dwa takie przykłady biomarkerów CSF o niskiej liczebności, które są mapowane na panelu w naszej kompleksowej analizie, ale nie można ich wiarygodnie wykryć przy użyciu naszej pojedynczej strategii stwardnienia rozsianego. Strategie celowania oparte na wielu przeciwciałach, takich jak PEA, mogą promować transformację kliniczną tych markerów.
Ogólnie rzecz biorąc, badanie to zapewnia unikalne podejście proteomiczne do identyfikacji i weryfikacji biomarkerów AD w płynie mózgowo-rdzeniowym w oparciu o różne systemy. Optymalizacja tych paneli markerów w dodatkowych kohortach AD i platformach stwardnienia rozsianego może okazać się obiecująca, jeśli chodzi o postęp w stratyfikacji i leczeniu ryzyka AD. Badania oceniające poziom tych paneli w czasie mają również kluczowe znaczenie dla ustalenia, która kombinacja markerów najlepiej stratyfikuje ryzyko wczesnej choroby i zmian w ciężkości choroby.
Z wyjątkiem 3 próbek skopiowanych przez CSF, wszystkie próbki CSF użyte w tym badaniu zebrano pod auspicjami Emory ADRC lub blisko powiązanych instytucji badawczych. W badaniach proteomicznych wykorzystano łącznie cztery zestawy próbek Emory CSF. Stwierdzono, że kohorta płynu mózgowo-rdzeniowego zawiera próbki od 20 zdrowych osób z grupy kontrolnej i 20 pacjentów z AD. Kopia 1 CSF zawiera próbki od 32 zdrowych osób kontrolnych, 31 osób z AsymAD i 33 osób z AD. Kopia 2 CSF zawiera 147 kontroli i 150 próbek AD. Kohorta 4 replikacji CSF obejmująca wiele chorób obejmowała 18 próbek kontrolnych, 17 próbek AD, 19 próbek ALS, 13 PD i 11 próbek FTD. Zgodnie z umową zatwierdzoną przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Emory, wszyscy uczestnicy badania Emory uzyskali świadomą zgodę. Zgodnie z wytycznymi National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centres z 2014 r. (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) płyn mózgowo-rdzeniowy pobierano i przechowywano poprzez nakłucie lędźwiowe. Pacjenci z grupy kontrolnej oraz pacjenci z AsymAD i AD przeszli standaryzowaną ocenę funkcji poznawczych w Emory Cognitive Neurology Clinic lub Goizueta ADRC. Próbki ich płynu mózgowo-rdzeniowego zbadano za pomocą INNO-BIA AlzBio3 Luminex pod kątem analizy ELISA Aβ1-42, całkowitego tau i p-tau (65 ). Wartości ELISA służą do wspierania klasyfikacji diagnostycznej pacjentów w oparciu o ustalone kryteria odcięcia dla biomarkerów AD (66, 67). Podstawowe dane demograficzne i diagnostyczne dla innych rozpoznań CSF (FTD, ALS i PD) uzyskuje się również z Emory ADRC lub stowarzyszonych instytucji badawczych. Podsumowanie metadanych przypadków dla tych przypadków Emory CSF można znaleźć w tabeli S1A. Charakterystykę kohorty 3 replikacji szwajcarskiego CSF ​​opublikowano wcześniej (45).
CSF znalazł próbkę. Aby zwiększyć głębokość naszego odkrycia zbioru danych CSF, przed trypsynizacją przeprowadzono zużycie immunologiczne białek o dużej zawartości. W skrócie, 130 µl płynu mózgowo-rdzeniowego z 40 pojedynczych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i równą objętość (130 µl) żywicy wyczerpującej białko High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372) umieszczono w kolumnie wirówkowej (Thermo Fisher Scientific, A89868) w temperaturze pokojowej. temperatura Inkubacja). Po wirowaniu przez 15 minut, odwiruj próbkę przy 1000 g przez 2 minuty. Do zatężenia próbki wycieku przez wirowanie przy 14 000 g przez 30 minut zastosowano ultraodśrodkowe urządzenie filtrujące 3K (Millipore, UFC500396). Rozcieńczyć wszystkie próbki do objętości 75 µl solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Stężenie białka oznaczono metodą z kwasem bicynchinowym (BCA) zgodnie z protokołem producenta (Thermo Fisher Scientific). Ubożony w odporność płyn mózgowo-rdzeniowy (60 µl) ze wszystkich 40 próbek trawiono endopeptydazą lizylową (LysC) i trypsyną. W skrócie, próbkę zredukowano i alkilowano 1,2 µl 0,5 M tris-2(-karboksyetylo)-fosfiny i 3 µl 0,8 M chloroacetamidu w temperaturze 90°C przez 10 minut, a następnie sonikowano w łaźni wodnej przez 15 minut. Próbkę rozcieńczono 193 µl 8 M buforu mocznikowego [8 M mocznika i 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] do końcowego stężenia 6 M mocznika. LysC (4,5 μg; Wako) stosuje się do trawienia przez noc w temperaturze pokojowej. Próbkę następnie rozcieńczono do 1 M mocznika za pomocą 50 mM wodorowęglanu amonu (ABC) (68). Dodać równą ilość (4,5 µg) trypsyny (Promega), a następnie inkubować próbkę przez 12 godzin. Zakwasić roztwór strawionego peptydu do końcowego stężenia 1% kwasu mrówkowego (FA) i 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) (66), a następnie odsolić za pomocą kolumny 50 mg Sep-Pak C18 (Waters), jak opisano powyżej (25) . Peptyd następnie eluowano 1 ml 50% acetonitrylu (ACN). Aby ujednolicić oznaczanie ilościowe białka w różnych seriach (25), połączono porcje po 100 µl ze wszystkich 40 próbek płynu mózgowo-rdzeniowego w celu wytworzenia próbki mieszanej, którą następnie podzielono na pięć próbek globalnego standardu wewnętrznego (GIS) (48). Wszystkie pojedyncze próbki i połączone wzorce suszy się w próżni o dużej prędkości (Labconco).
CSF kopiuje próbkę. Dayon i współpracownicy opisali wcześniej utratę odporności i trawienie próbek 3 kopii płynu mózgowo-rdzeniowego (45, 46). Pozostałe powtórzone próbki nie miały indywidualnie obniżonej odporności. Rozpuścić te nieusunięte próbki w trypsynie, jak opisano wcześniej (17). Do każdej powtarzanej analizy 120 µl porcje eluowanego peptydu z każdej próbki łączono razem i dzielono na porcje o równej objętości, które miały być użyte jako globalny standard wewnętrzny znakowany TMT (48). Wszystkie pojedyncze próbki i połączone wzorce suszy się w próżni o dużej prędkości (Labconco). Aby wzmocnić sygnał białka CSF o niskiej liczebności, łącząc 125 µl z każdej próbki, do każdej analizy replikacyjnej przygotowano „wzmocnioną” próbkę [tj. próbkę biologiczną, która naśladuje próbkę badawczą, ale dostępna ilość jest znacznie większe (37, 69)] połączone w mieszaną próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego (17). Zmieszaną próbkę następnie usunięto immunologicznie przy użyciu 12 ml żywicy High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), strawiono jak opisano powyżej i uwzględniono w kolejnym wielokrotnym znakowaniu TMT.